蒙藥梅花草化學成分抗腫瘤活性研究

阿如汗，紅 艷，達拉胡，辛 穎

（1. 內蒙古民族大學 蒙醫藥學院，內蒙古 通遼028000；2. 庫倫旗蒙醫醫院 制劑室，內蒙古 庫倫028200）

梅花草（孟根地格達）系虎耳草科梅花草屬植物梅花草（Parnassia palustrisLinn.）的干燥全草，具有破痞去滯、抑協日（清除血液中的濁物）和除熱解毒等功效，在蒙醫臨床實踐中用于治療肝血痞、間熱痞、內熱痞、脈痞、腸協日痞、臟腑協日癥等［1-4］.依據蒙醫藥古籍文獻記載，梅花草的首要功效為破痞，破痞屬于蒙藥功效的一種分類類型，在現代蒙藥藥理學中破痞被描述為抗腫瘤作用［5］.通過本課題組的前期研究，發現梅花草的石油醚、二氯甲烷萃取部位是其抗腫瘤的活性部位，并從中分離得到11個單體化合物［6-8］.筆者將對梅花草二氯甲烷有效部位中分離的5種單體化合物成分celahin B、mussaenin A、gardendiol、isoboonein 和4-epi-alyxialactone 開展抗腫瘤活性篩選，旨在為進一步研究蒙藥梅花草的破痞藥效物質基礎提供實驗數據.

1 材料與儀器

1.1 原材料 本研究所用的藥材樣本采集于2015年7月，采集地為內蒙古自治區通遼市扎魯特旗罕山，經內蒙古民族大學蒙醫藥學院藥用植物學與鑒定學教研室徐都冷教授鑒定為梅花草（Parnassia palustrisLinn.），室內陰干，待用.

1.2 實驗細胞株 實驗用細胞株（Hela、HepG2）均從上海博谷生物科技有限公司購買.

1.3 實驗藥物與試劑 化合物celahin B、mussaenin A、gardendiol、isoboonein、4-epi-alyxialactone 均由實驗室自制；胎牛血清（FBS）、細胞培養基（DMEM，高糖）、二甲基亞砜（DMSO，細胞用）、胰蛋白酶（1：250）、雙抗（青霉素、鏈霉素）、MTT等均從美國Gibco公司購買；生理鹽水、乙醇、二氯甲烷等分析純試劑均購自天津科密歐公司.

1.4 實驗儀器 TS100型倒置熒光顯微鏡（日本尼康）；SW-CJ-2F型超凈工作臺（蘇州智凈有限公司）；3110 型CO2培養箱（美國Thermo Scientific）；DNM-9602 型酶標儀（北京普朗責任有限公司）；YXQ-LS-100A型立式高壓鍋（上海博訊有限公司）；DHG-9203A型恒溫干燥箱（上海精宏有限公司）；KQ-100型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）.

2 實驗方法

2.1 化合物的制備 取約1.5 kg的干燥梅花草全草，使用95%乙醇回流提取，4h/次，共3次.經減壓濃縮得梅花草的乙醇提取物.乙醇提取物被水混懸后，依次被石油醚、二氯甲烷萃取得40 g 石油醚萃取物和60 g二氯甲烷萃取物.梅花草的二氯甲烷萃取物經硅膠色譜柱分離，流動相（石油醚：丙酮，v∶v=100∶1→10∶1）梯度洗脫，薄層鑒別后合并斑點相同的流份.其中，流份2（280 mg）經適量石油醚溶解、過濾后，以石油醚-丙酮（v∶v=17∶1）為展開劑，薄層分離鑒別出化合物1（15 mg）和化合物2（11 mg）；流份3（405 mg）經適量二氯甲烷溶解、過濾后，以石油醚-丙酮（v∶v=12∶1）為展開劑，薄層分離鑒別出化合物3（20 mg）、化合物4（14 mg）和化合物5（17 mg）.經13C-NMR、1H-NMR核磁數據鑒定，結合文獻報道分析，化合物1～5分別為celahin B（1）、mussaenin A（2）、gardendiol（3）、isoboonein（4）和4-epi-alyxialactone（5）［9-13］.

2.2 抗腫瘤活性實驗

2.2.1 細胞培養及給藥 Hela、HepG2細胞的培養條件為：含10% FBS的DMEM培養基，5% CO2、37℃的培養環境，培養48～72 h 傳代1 次.當腫瘤細胞的生長達到對數生長期時，可對其進行消化、計數和接種（96孔板的接種密度為1.0×105個/mL）.實驗分為空白對照組和藥物刺激組，加藥處理一般選擇接種后繼續培養的24 h 以后，每組8 個復孔.藥物刺激組包括分別加入化合物celahin B、mussaenin A、gardendiol、isoboonein和4-epi-alyxialactone 的不同濃度（25、50、75、100、200 μg/mL）組，空白對照組加入等體積的不含FBS的DMEM培養基.

2.2.2 MTT 法檢測抗腫瘤活性 藥物處理24 h可進行細胞活性檢測，先吸棄掉細胞培養板中每孔的培養基，加入MTT溶液（1mg/mL）50 μL/孔，培養箱中繼續培養4 h，吸掉MTT后加入DMSO（100 μL/孔），酶標儀（490 nm）檢測培養板中各實驗組的OD值，并計算各化合物對腫瘤細胞增殖的抑制率.抑制率等于空白對照組的平均OD值與藥物組平均OD值的差再除以空白對照組的平均OD值的比率.

2.3 統計學方法 數據以均數±標準差表示，各組實驗數據的統計學分析通過SPSS17.0軟件實現，當P＜0.05，則認為差異具有顯著性的統計學意義.

3 實驗結果

3.1 celahin B對腫瘤細胞增殖的影響 celahin B在濃度為50～200 μg/mL時，對Hela、HepG2細胞的增殖均有顯著的抑制作用，與對照組相比均具有統計學意義.當濃度為75 μg/mL及以上時，對Hela、HepG2細胞的增殖抑制率均大于50%.結果見表1.

表1 celahin B對腫瘤細胞增殖的影響（xˉ±s，n=8）Tab. 1 Effect of celahin B on tumor cell proliferation（xˉ±s，n=8）

3.2 mussaenin A 對腫瘤細胞增殖的影響 mussaenin A 在濃度為75～200 μg/mL時，對Hela、HepG2細胞的增殖均有顯著的抑制作用，與對照組相比均具有統計學意義.當濃度為100 μg/mL及以上時，抑制率均可達到50%以上.結果見表2.

表2 mussaenin A對腫瘤細胞增殖的影響（xˉ±s，n=8）Tab. 2 Effect of mussaenin A on tumor cell proliferation（xˉ±s，n=8）

3.3 gardendiol 對腫瘤細胞增殖的影響 在濃度為100～200 μg/mL 時，gardendiol 對Hela、HepG2 細胞的增殖均有顯著的抑制作用，當濃度為200 μg/mL時，對Hela細胞增殖抑制率大于50%.結果見表3.

表3 gardendiol對腫瘤細胞增殖的影響（xˉ±s，n=8）Tab. 3 Effect of gardendiol on tumor cell proliferation（xˉ±s，n=8）

3.4 isoboonein 對腫瘤細胞增殖的影響 isoboonein 的濃度為100 μg/mL 及以上時，對Hela、HepG2 細胞的增殖才呈現出抑制活性.結果見表4.

表4 isoboonein對腫瘤細胞增殖的影響（xˉ±s，n=8）Tab. 4 Effect of isoboonein on tumor cell proliferation（xˉ±s，n=8）

3.5 4-epi-alyxialactone 對腫瘤細胞增殖的影響 4-epi-alyxialactone 在濃度為50～200 μg/mL 時，對Hela、HepG2細胞的增殖均有顯著抑制.當濃度為75 μg/mL及以上時，抑制率大于50%.結果見表5.

表5 4-epi-alyxialactone對腫瘤細胞增殖的影響（xˉ±s，n=8）Tab. 5 Effect of 4-epi-alyxialactone on tumor cell proliferation（xˉ±s，n=8）

4 討論

本課題組通過前期工作研究明確了梅花草的抗腫瘤活性，并篩選出其抗腫瘤的活性部位，探討其促腫瘤細胞凋亡的初步機制［14-16］.同時，利用常規柱色譜法從梅花草的抗腫瘤活性部位-二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物中分離得到11 個單體化合物（celahin B、mussaenin A、gardendiol、isoboonein、4-epi-alyxialac?tone、槲皮素、綠原酸、山奈酚、金絲桃苷、沒食子酸和山奈酚-3-O-β-蕓香糖苷）.經查閱文獻發現，梅花草的化學成分槲皮素、綠原酸、山奈酚、金絲桃苷和沒食子酸均有不同程度抗Hela、HepG2細胞增殖的活性，且總體機制與誘導其凋亡相關［17-21］.

本研究通過體外實驗研究證實梅花草的化學成分celahin B、mussaenin A、gardendiol、isoboonein和4-epi-alyxialactone均有不同程度抑制Hela、HepG2細胞增殖的作用，并呈現出濃度依賴性.celahin B、4-epialyxialacton 對Hela 細胞和HepG2 細胞增殖具有很強的抑制活性，當濃度為75 μg/mL 時，抑制率分別為63.73%、63.45%和51.93%、49.69%；當應用celahin B、4-epi-alyxialacton 的最大安全濃度（200 μg/mL）時，抑制率可達72.11%、71.17%和64.63%、59.71%.mussaenin A 濃度為100 μg/mL 時，對Hela、HepG2 細胞增殖的抑制率是56.39%和48.62%.gardendiol 濃度為200 μg/mL 時，對Hela 細胞增殖的抑制率為56.42%.而化合物isoboonein 只有當濃度為200 μg/mL 時，才顯示出體外抑制腫瘤細胞增殖的活性，抑制率為43.77% 和34.37%.

綜上所述，梅花草中celahin B、mussaenin A、gardendiol、isoboonein 和4-epi-alyxialactone 等化學成分在體外均呈現出不同程度的抑制腫瘤細胞增殖的作用，該實驗結果可為進一步開展蒙藥梅花草破痞功效的藥效物質基礎研究提供參考.