不同林齡杉木林土壤細菌群落結構與土壤酶活性變化研究

曹 升,潘 菲,林根根,張燕林,周垂帆,,*,劉 博

1 福建農林大學林學院，福州 350002 2 人工林可持續經營福建省高校工程研究中心，福州 350002 3 福建省長汀縣水土保持站，龍巖 366300

杉木作為速生樹種,種植歷史悠久,且在我國南方大量分布。杉木的凋落物少、養分回歸土地周期長以及大面積杉木純林的持續種植,使土壤養分與天然混交林土壤養分變化規律有較大差異。杉木人工林種植周期的確定往往基于經濟效益與碳匯收益[1],而種植周期長短對土壤質量的影響常被忽略。土壤肥力與杉木人工林的生長及其可持續發展密切相關,因此在確定杉木人工林種植周期時,還需考慮土壤質量隨林齡變化的規律。此外,目前有關杉木人工林的研究多聚焦于杉木幼齡林和中齡林,缺乏對成熟林和過熟林土壤的研究[2-3],這極大限制了我們對杉木林土壤質量隨種植年限變化的認知。

土壤生物學指標(如土壤細菌與土壤酶)與土壤性質密切相關,均對土壤質量變化十分敏感[4-5]。研究表明,細菌群落結構受到土壤植被、理化性質、有機質含量等的影響,能在土壤環境改變時快速做出反應[6]。因此,通過對不同發育階段杉木林土壤中細菌群落結構進行測定,能夠及時有效的監測土壤微生物群落及功能變化,這對揭示人工林經營引起土壤質量演變的微生物學機理具有重要意義。國內目前已有較多學者對杉木林土壤微生物結構進行過分析,研究發現,3a、12a與38a的杉木林土壤中,微生物代謝活性與多樣性指數逐漸增加,這與土壤pH值。碳氮比和全氮的含量變化有關[7]。魏志超對幼、中、老年的杉木林土壤做了微生物多樣性分析,發現幼年林的多樣性最高,但均勻度不夠,推測是由于幼年林樣地環境復雜植被數目覆蓋度低導致[8]。也有學者對1、4、10、18、32a的杉木林土壤進行微生物數量的研究后發現,土壤中微生物數量隨著林齡的增加呈現先上升后下降趨勢[9]。目前土壤細菌對杉木林齡變化的響應機制并未明確,得出的細菌群落變化規律不一,因此亟需進一步分析杉木林齡對土壤細菌活性影響,揭示不同林齡杉木林土壤細菌群落特征。

土壤酶作為一種活性物質,對土壤物化性質的改變極其敏感[10]。前人研究表明,人工林隨著種植年限的增加,其土壤酶活性會產生顯著變化[11]。土壤脲酶、酸性磷酸酶、β-N-乙酰基葡萄糖苷酶、蔗糖酶均與人工林土壤質量密切相關,其活性能迅速對土壤養分變化產生響應,常被作為評價土壤質量的重要指標[12]。由于酶活性與土壤中生化反應息息相關,因此其活性與土壤細菌活性關系密切[13]。目前對于森林土壤中酶活性研究,多集中于與土壤養分、林下植被的關系。對于不同林齡杉木林的土壤細菌群落與酶之間的關系研究鮮有報道,本文對土壤養分、細菌群落以及酶活性的研究,有利于進一步了解不同酶活性在不同林齡杉木林中的變化特征,為杉木人工林合理種植提供依據。。

鑒于此,本實驗通過采集不同林齡杉木人工林土壤樣品,對不同林齡杉木林的土壤養分進行測定,利用高通量測序中16SrDNA區對細菌的DNA進行物種注釋,挖掘出不同的樣本中細菌物種的差異性。同時,本實驗挑選出與酸性土壤及土壤細菌活性密切相關的四種酶進行測定。進而探討不同林齡杉木人工林土壤養分與土壤細菌群落、土壤酶活性之間的關系,揭示土壤微生物與土壤酶對杉木林齡變化的響應規律,為有效評價監測杉木林土壤質量提供科學依據。

1 材料與方法1.1 研究區概況與樣品采集

福建省南平市是我國杉木的中心產區之一。南平市杉木種植歷史悠久,分布著大量的杉木人工林。該地為亞熱帶季風氣候,氣候溫暖潮濕,年平均溫度19.3℃,相對濕度為83%,年平均降水量為1699mm,主要集中在3月份到8月份[14]。土壤為由花崗巖為母質發育而成的紅壤。土壤樣品采集于南平市溪后村(26°39′N,117°55′E),在該地選擇立地條件相似,林齡不一的五片杉木人工林,分別為4年林(4a),15年林(15a),24年林(24a),43年林(43a)與100年林(100a),樣地位置見圖1。其中4a為幼齡林,15a為中齡林、24a為近熟齡,43a與100a為過熟林。采樣時間為2018年7月27、28日,樣品采集時均為晴天。每片林地選擇三個相似的土坡,土坡的坡度為30°—40°,坡向均為東南向。喬木層主要以杉木為主,4a土地植被覆蓋度較低,林下植被主要以芒萁為主,另有薄蓋短腸蕨、五節芒等少量草本植物分布,15a與24a植被豐富度上升,灌木層植物主要有山蒼子、毛冬青、鹽膚木、木荷、虎皮楠等,草本層植物主要有芒萁、狗脊、烏毛蕨、扇葉鐵線蕨、黑莎草、五節芒等。過熟林(43a與100a)灌木層植物數量更為豐富,主要有粗葉榕、青岡、毛冬青、苦櫧、鹽膚木、細圓藤等,草本層主要有觀音座蓮蕨、淡綠短腸蕨、狗脊、華山姜、黑莎草等。每個土坡上劃定20m×20m的采樣地,沿著S形選擇六個采樣點,在去除表層枯枝落葉層后,用土鉆采集0—20cm的表層土壤,并將六個采集點的土樣等量混合為一份樣品。每片人工林采集三個樣品。每份土壤樣品過20目篩后放入4℃的冰箱中冷藏保存,一部分用于土壤細菌檢測,一部分用于測定土壤酶與進行理化性質分析。其中土壤理化性質測定結果如表1。

圖1 研究區域位置圖Fig.1 Location map of study area

1.2 土壤細菌測定

從樣品中提取細菌的DNA,通過引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA- 3′)與806(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)與銜接子序列和條形碼序列組合來擴增細菌16SrRNA的V3和V4區域。PCR反應體系包括60ng的基因組DNA、10μLBuffer,0.2μLQ5高保真DNA聚合酶,10μL高GC增強劑,1μLdNTP,10μM每種引物,最后用滅菌超純水補充總體系到50μL。PCR的反應條件為：95℃5min,95℃1min,50℃1min,72℃1min15個循環,最后在72℃反應7min,最后置于4℃的環境中。擴增后的PCR產物進行第二輪純化處理,其包含20μL2×PhusionHF MM,8mL滅菌超純水,10μM每種引物和上一步的10μLPCR產物。熱循環條件如下：98℃30s,98℃10s、65℃30s、72℃30s,最終在72℃下反應5min,然后使用1.8%的瓊脂糖凝膠電泳40min。最后,對純化后的產物進行Nanodorp 2000定量,將產物按照1∶1進行混樣,最后切膠回收。在北京百邁克生物科技有限公司進行高通量測序分析。

表1 不同林齡杉木林土壤主要理化性質

1.3 土壤酶測定

土壤酸性磷酸酶活性的測定原理為測定酸性環境下,其催化磷酸苯二鈉水解生成的苯酚的生成量。將37℃中每克土每天釋放的1μmol酚定義為一個酶活性單位來表示其活性[15]。

土壤脲酶活性的測定是利用靛粉藍比色法,測定出脲酶在水解尿素的過程中產生的NH3-N含量。每克土每天產生的1μg NH3-N定義為一個酶活力單位。

土壤β-基葡萄糖苷酶的測定原理是為該酶能分解β-N-乙酰基葡萄糖苷生成對-硝基苯酚,生成物在400nm有最大吸收值,并通過酶標儀來測定吸光值升高速率來計算該酶的活性。將每克土每天產生的1μmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

土壤蔗糖酶活性測定原理為該酶能催化蔗糖降解產生果糖與葡萄糖并與3、5-二硝基水楊酸反應,根據生成的紅棕色氨基化合物在510nm光的吸收增加速率來計算該酶的活性。將每天每克土產生的1mg還原糖定義為一個酶活力單位[16]。

以上酶測定均使用酶標儀(SpectraMax M4,美國)測出。

1.4 數據分析

細菌數據分析是基于Illumina HiSeq 測序平臺,將測序得到的雙端reads數PE Reads利用FLASH v1.2.7軟件進行拼接得到Raw Tags,使用軟件Trimmomatic v0.33對Raw Tags過濾后得到Clean Tags,再使用UCHIME v4.2軟件對其進行過濾嵌合體最后得到有效Tags數據。這種通過對Reads過濾與雙端拼接并去除嵌合體方法處理后,能得到高精確度的微生物種群數據[17]。將優化后的數據進行OTUS(Operational Taxonomic Units)聚類,使用QIIME(version1.8.0)軟件[18]進行物種注釋以及豐度分析、系統分類、主成分分析等。

使用EXCLE2010、SPSS20.0進行了數據處理與分析,其中在SPSS中使用單因素方差分析、LSD多重比較進行了數據對比分析,樣品均值比較的最小顯著差異檢驗的顯著性水平為0.05.使用Origin 2018等軟件分析繪制出實驗數據圖表。使用Canoco 4.5對土壤養分、土壤微生物與酶之間的關系進行冗余分析。

2 結果分析2.1 土壤細菌測序統計

各階段的序列數、有效率以及覆蓋率可反映數據質量。不同林齡土壤細菌樣本測定的原始序列數(Raw tags)均在60000條以上,有效序列數(Clean tags)均在50000條以上,有效率均達到86%以上,覆蓋率均高于99%(表2),說明樣本中細菌測出率較高,結果足以足以反映樣本的真實情況。

表2 細菌測序處理結果統計

2.2 細菌群落OTU數目與多樣性分析

對樣品Tags中相似度高于97%的序列進行劃分定義為一個OTU(Operational Taxonomic Units),OTU個數能直觀反應出不同樣品中細菌種群豐富程度。Alpha多樣性(Alpha diberdity)能同時反應單個樣品物種豐度與物種多樣性。其中包含的Chao1能反映物種豐度,香農(Shannon)指數能反映物種的多樣性。Shannon指數越小說明群落多樣性越低。表3中細菌OUT數量隨著林齡依次增加,表明隨著林齡增長,杉木林土壤中細菌種群豐度上升。從表格中Chao1值可看出,細菌的豐度隨著林齡的增加而增加。從Shannon指數可以看出細菌多樣性15a近熟林期間要高于幼年林4a與成熟林24a,過熟林43a與100a細菌的多樣性無顯著差異。

表3 不同林齡杉木林細菌Alpha多樣性分析

圖2為等級豐度曲線,基于五個樣品的相對豐度繪制而成,曲線在橫軸寬窄能表示物種組成的豐富程度,曲線的平緩程度能表明物種的均勻程度。圖2中曲線顯示樣品曲線隨著林齡增加而放緩,說明隨著杉木林齡的增長,細菌種群均勻度增加。

2.3 土壤細菌結構分析

主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)可以將多組數據的差異反映在二維坐標圖中。圖中點距離的遠近可表示樣品組間組成成分的相似度。圖3中可15a與43a大部分位于第一象限,100a、24a、4a分布在第二、三、四象限,各樣品間細菌群落多樣性均有較大差異。幼年期杉木林由于林下植被稀疏,4a樣品屬于林下植被較為稀疏的幼年期杉木林土壤,其微生物群落不僅分布均勻度較低,群落結構也有較大差異性。24a土壤細菌與其余樣品差異較大。15a與43a細菌群落結構相似性較高,43a與100a的細菌群落結構也具有一定相似性。不同林齡的樣品在圖中分布位置相對獨立,說明不同林齡土壤細菌群落結構有比較顯著的差異。

圖2 不同林齡土壤細菌等級豐度曲線Fig.2 Bacterial grade abundance curve of different forest ages

圖3 不同林齡土壤細菌PCA圖Fig.3 Bacterial PCA map of soil in different ages

2.4 細菌群落組成與結構分析

不同林齡土壤樣本中共檢測出25個菌門,選取土壤細菌優勢種的分類單元,構建土壤細菌系統分類樹(圖4)。可以從圖中看出微生物的進化關系,餅圖的半徑越大,該物種的豐度越高。不同顏色代表不同樣品,不同樣品在餅圖中所占面積越大,說明該物種豐度在樣品中相對其他樣品含量更高。從餅圖中可看出,大部分物種較均勻,小部分物種屬于稀有門類,僅在部分樣本中發現。如圖所示,酸桿菌門(Acidobacteria)和變形菌門(Proteobacteria),是土壤中的優勢菌種。放線菌門(Actinobacteria)隨著林齡的增加相對豐度呈現下降趨勢。黃桿菌屬(Flavobacterium)絕大部分分布于43a與100a中,芽孢桿菌屬(Bacillus)在15a中含量最多,100a中分布最少,亞硝化單胞菌(Nitrosomonadaceae)在100a中含量最高。黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)在24a中含量最高。

圖4 不同林齡土壤細菌系統分類樹Fig.4 Soil bacterial taxonomy tree of Chinese fir forests with different ages

2.5 土壤酶含量分析

對不同林齡杉木林土壤的酶活性進行分析(表4),脲酶在4a中含量最低,為363.29 μmol/g,到15a時上升到529 μmol/g,在24a時下降到455.92 μmol/g,43a與100a時分別為480.85 μmol/g與545.14 μmol/g,均與4a呈現顯著差異(P<0.05)。蔗糖酶在24a比15a少量增加,但整體呈現下降趨勢。β-N-乙酰基葡萄糖苷酶的波動較大,與酸性磷酸酶呈現趨勢大致相同。

表4 不同林齡杉木林土壤酶活性

2.6 土壤養分、土壤細菌與酶活性之間的冗余分析與相關性分析。

圖5 土壤養分、細菌相對豐度與酶活性相關性分析Fig.5 Correlation analysis between soil nutrient, relative abundance of bacteria and enzyme activityAci：酸桿菌門,Pro：變形菌門,Chl：綠彎菌門,Act：放線菌門,Ver：疣微菌門,Fir：厚壁菌門,Pla：浮霉菌門,Gem：芽單胞菌門。Nit：硝化螺旋菌門,Bac：擬桿菌,S-SC：蔗糖酶,S-UE：脲酶,S-NAG：N-β-葡萄糖苷酶,S-ACP：酸性磷酸酶

3 討論

3.1 不同林齡杉木林土壤細菌群落組成變化

杉木林土壤微生物與土壤質量關系密切,可以通過微生物的活躍程度及種群數量變化探知林齡對土壤微生物的影響。本研究中不同林齡杉木林,在土壤類型、管理方式基本相似的情況下,細菌群落結構隨林齡變化顯著。根據等級豐度曲線,土壤中細菌群落的多樣性與豐富度均隨著林齡的增加規律上升。隨著森林發育年份增加,人為干擾降低,林下植被增長以及腐殖質累積有利于微生物種群數量的增長[19]。類似的一些研究表明,林齡較大、郁閉度較高的人工林土壤微生物多樣性較高,研究結果與本研究結果一致[20-21]。因此若杉木人工林種植時間過短,會對土壤細菌生物量產生顯著影響,不利于土壤質量提升。細菌群落數量總體增加,但具體的細菌種群增長下降情況不一,還需對不同林齡中具體細菌群落進行分析。根據高通量測序結果,本研究4a中細菌結構與其他林齡細菌結構相比,相似度最低,15a與24a、43a與100a相似較高,說明杉木林在發育中的四個階段(幼年林、中齡林、成熟林,過熟林)過程中細菌結構特點出現變化。前人的研究指出在不同發育階段杉木對不同養分的消耗利用率不一[22],導致與土壤養分密切相關的具體細菌群落隨養分在杉木不同發育期中發生變化[23]。

3.2 不同林齡杉木林土壤酶活性變化

土壤細菌是土壤酶的重要來源,大部分酶活性高低主要受微生物形成代謝釋放的活性物質影響,酶催化下的生化反應也能影響微生物活性。因此,細菌群落結構與酶活性具有直接相關性[42]。本研究中關于酶與細菌的相關性分析表明,放線菌與蔗糖酶呈現極顯著正相關,與脲酶呈現極顯著負相關,由于放線菌與有機質分泌密切相關,由此說明可溶性有機質含量變化也與脲酶、蔗糖酶存在緊密聯系。脲酶與綠彎菌門、變形菌門以及浮霉菌門都有顯著相關性,表明這類細菌隨著林齡增長出現的群落變化,以及其分泌的活性物質的改變都會對脲酶產生影響。其他未出現顯著相關性的微生物與酶,可能是由于兩者之間不單純是單線的影響關系,影響因素還包括真菌以及土壤動植物。

4 結論

綜上,土壤酶活性與土壤養分含量以及細菌群落結構之間聯系密切。土壤細菌群落結構與酶活性均可作為土壤質量變化的健康指標,對有效評判杉木林土壤質量變化有重要意義。適當延長杉木人工林種植年限,有利于維護杉木人工林土壤細菌群落多樣性與提高土壤質量,以達到可持續經營管理的目的。

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