雙水相法制備花生衣高純度黃酮及其抗氧化的研究

蔣新龍 蔣益花 何星谷

(浙江樹人大學生物與環(huán)境工程學院，杭州 310015)

近年來天然抗氧化劑已成為食品領域研究熱點之一[1]。黃酮類化合物是一大類天然產物，黃酮類化合物因其獨特的結構而具有良好的抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗過敏、抗衰老、抗心腦血管病、免疫調節(jié)等作用[2]。其中抗氧化作用是黃酮類化合物最重要的生物活性[3]，在食品工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)有廣泛的應用[4,5]。

花生衣是花生加工的附屬產物，其主要成分為原花青素、兒茶素、維生素K、白藜蘆醇等生物活性物質[6]，還含有多種黃酮類成分，包括槲皮素、原花色素低聚物等功能成分[7]，但大多被丟棄或作為廉價飼料及燃料使用。針對天然抗氧化劑市場的需求及花生衣資源化綜合利用問題，以花生衣為原料，用超聲-微波協同雙水相制備黃酮粗提物；采用多級雙水相體系純化黃酮粗提物得到高純度黃酮；以VC作對照，比較所得黃酮粗提物和高純度黃酮的抗氧化活性相對大小，為花生衣變廢為寶綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

花生衣：50 ℃鼓風干燥，粉碎過40目篩，備用。蘆丁 (批號100080-200707)、DPPH；所用其他試劑均為分析純。

CW-2000型超聲-微波協同萃取/反應儀，UV-1600型紫外可見光譜儀，GZX-91400MBE電熱恒溫鼓風干燥箱，AB204-N 型分析天平。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮的測定

根據硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測定黃酮含量[8]，得蘆丁質量濃度C(mg/mL)與吸光度A之間的關系式為：A=25.289C+0.037 2，相關系數r=0.997 3。

精密稱取一定質量的原料置于提取容器中，加入由一定體積一定濃度乙醇溶液和一定質量的無機鹽組成的雙水相體系，在一定提取條件下提取一定時間，趁熱抽濾得濾液。靜置5 min，待其分層，收集上清液，得到黃酮提取液。精密吸取黃酮提取液，以相應的試劑空白溶液為空白對照，根據硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測定黃酮含量[8]。按回歸方程計算樣品液中黃酮得率Y。

式中：n為稀釋倍數；m為原料質量/g；V為提取液總體積/mL；C為回歸方程的計算值/mg/mL。

1.2.2 黃酮提取實驗設計

雙水相體系的確定：徐方祥等[9]用微波輔助乙醇-磷酸氫二鉀雙水相的方法對菠蘿皮中黃酮進行提取。根據池汝安等[10]采用濁點法所繪制的各雙水相體系相圖和南二龍[11]所建立的相比數據庫，本研究選取磷酸氫二鉀作為分相鹽、乙醇作為有機相組成乙醇-磷酸氫二鉀雙水相提取黃酮。

超聲-微波協同雙水相提取花生衣黃酮：依據1.2.1方法，在原料質量0.500 0 g、磷酸氫二鉀用量7 g、乙醇體積分數50%、液料比100∶1、微波時間30 min、微波功率300 W的條件下，采用控制變量法進行單因素實驗。分別設置磷酸氫二鉀用量梯度6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 g；乙醇體積分數梯度40%、50%、60%、70%、80%；液料比梯度40∶1、60∶1、80∶1、100∶1、100∶1；提取時間梯度為10、20、25、30、40 min；微波功率梯度為100、200、300、400、500、600 W，考量磷酸氫二鉀用量、乙醇體積分數、液料比、提取時間和微波功率五因素對黃酮得率的影響。在單因素實驗基礎上，以磷酸氫二鉀用量或乙醇濃度為固定值，選取其他四個因素為自變量，利用正交實驗 L9(34)對提取條件進行優(yōu)化。

1.2.3 黃酮純化實驗設計

利用多級雙水相體系制備高純度黃酮：用最佳工藝條件進行雙水相提取，得上相1；將上相1用旋轉蒸發(fā)儀濃縮(設定溫度40 ℃)至無乙醇得到濃縮液1，冷凍干燥濃縮液1可得粗黃酮產品1；將濃縮液1加入一定量無水乙醇和磷酸氫二鉀重新得到最佳提取條件時的雙水相體系，以4 000 r/min離心20 min，得上相2，旋轉蒸發(fā)儀濃縮上相2得到濃縮液2，冷凍干燥濃縮液2可得純化黃酮產品Ⅱ。分別測定兩次雙水相上相和下相中黃酮含量，求出兩次雙水相體系的分配系數和兩個黃酮產品的純度。

1.2.4 黃酮抗氧化活性實驗設計

將粗黃酮產品和純化黃酮產品加無水乙醇配制成100 μg/mL的高濃度溶液，再用無水乙醇稀釋成2、5、8、10、20、40、60、80 μg/mL的樣品溶液。以VC做參比，以半數清除率IC50值為抗氧化活性評價指標，比較花生衣粗黃酮、花生衣純化黃酮、VC抗氧化活性相對大小。

DPPH·法是目前用以評價天然抗氧化劑抗氧化活性的一種簡便、快速、靈敏可行的方法[12]。具體根據本團隊方法實驗[13]，計算DPPH·的清除率，并與VC的清除DPPH·能力進行比較。

1.3 統計方法及分析軟件

指標均重復測定3次并取平均值，利用Origin 8軟件作圖；應用SPSS20.0軟件進行數據統計，并用Duncan多重比較(SSR法)檢驗各處理平均數之間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 黃酮提取實驗

2.1.1 單因子實驗

單因子提取實驗結果如圖1所示。

圖1 單因子提取實驗結果

磷酸氫二鉀用量的影響：在乙醇-磷酸氫二鉀雙水相中，上相由混有少量水的乙醇構成，醇溶性黃酮提取后進入上相，下相由溶有磷酸氫二鉀的水及少量乙醇構成。雙水相的形成是乙醇與磷酸氫二鉀爭奪水分子的過程。鹽的用量改變可影響上相的極性，隨著鹽用量的增加，鹽對水的束縛能力增強，使上相中乙醇的相對體積分數增加[14]，最終影響到黃酮的得率。磷酸氫二鉀用量為7.0 g時，黃酮的得率達到最高值。后續(xù)實驗中固定磷酸氫二鉀用量為7.0 g/50 mL，通過優(yōu)化調節(jié)乙醇體積分數獲得高選擇性雙水相體系。

乙醇體積分數對黃酮得率的影響：乙醇體積分數50%時黃酮得率達到最高值。乙醇體積分數直接影響雙水相萃取效果，乙醇量太多會導致鹽的析出，太少則無法形成雙水相。因此，初步確定乙醇最佳體積分數為50%。

液料比對黃酮得率的影響：液料比在30～110 ∶1范圍內，黃酮得率隨著液料比的增加而提高，液料比為100 ∶1時，黃酮得率已達到接近最高值，再增大液料比黃酮得率提高不多。因此，初步選取最佳液料比為100 ∶1。

提取時間對黃酮得率的影響：在30 min時間內，黃酮得率隨提取時間增加而提高，但超過30 min，黃酮得率不增反降，這主要由于黃酮中的酚羥基容易被氧化，故初步選取最佳提取時間為30 min。

微波功率對黃酮得率的影響：微波功率過高，體系升溫過快，容易加速黃酮的氧化與降解。隨著微波功率的增加，黃酮得率先增加后減少，在300 W時達到最大值。故初步選取最佳微波功率為300 W。

2.1.2 正交實驗及結果分析

因為磷酸氫二鉀用量7 g/50 mL與其他水平差異顯著，所以正交實驗時以磷酸氫二鉀用量為固定值，通過優(yōu)化調節(jié)乙醇體積分數獲高選擇性雙水相體系。正交實驗選取乙醇濃度、液料比、微波時間和微波功率四個因素為自變量，以黃酮得率為評價指標，利用正交實驗 L9(34)對提取條件進行優(yōu)化，四因子三水平正交實驗的因子與水平見表1，正交實驗結果及分析見表2，方差分析表見表3。

由表2的直觀分析可知，水平組合A3B2C1D3最佳，得率為22.92%。由表2的極差分析，黃酮提取是A3B2C1D1最佳。由表3的方差分析可知，對黃酮得率的影響乙醇濃度(B)極顯著，液料比(A)顯著，提取時間(C)和微波功率(D)則不顯著；對花生衣提取的影響影響依次為：B>A>C>D，與極差分析結果完全一致。Duncan多重比較分析，花生衣提取中微波功率(D)三水平之間無顯著差異。綜合分析提取成本和得率，確定花生衣黃酮的最佳工藝條件分別為A3B2C1D1。

表2 正交實驗結果及分析

表3 方差分析表

根據最佳提取工藝條件進行驗證實驗，當磷酸氫二鉀質量濃度7 g/50 mL(即140 mg/mL)、液料比100 ∶1、乙醇體積分數50%、提取時間20 min，微波功率為200 W時，花生衣得率為22.86%。實驗結果與預測值無顯著差異。

2.2 黃酮純化實驗結果與分析

實驗結果表明，一級雙水相體系提取后再進行二級雙水相體系純化，花生衣黃酮的分配系數由3.41增加到7.91，純度由51.04%增加到80.17%。花生衣黃酮的分配系數和純度分別提高2.3倍、1.6倍。白甫等[15]采用大孔吸附樹脂純化花生衣中總黃酮成分，總黃酮純度達66.12%。所以利用多級雙水相體系純化制備高純度花生衣黃酮是可行的。

2.3 黃酮抗氧化實驗結果與分析

測定對DPPH·的清除率，并以相同質量濃度的VC作為陽性對照，黃酮清除DPPH·自由基的能力比較如圖2所示。根據圖2的量效關系構建濃度和清除率的線性方程，并求出清除率為50%時所需的濃度(IC50)，花生衣黃酮清除DPPH·自由基的能力見表4。表4表明，VC、花生衣粗黃酮、花生衣純化黃酮在實驗濃度范圍內與清除DPPH·自由基呈現出良好的量效關系。VC、花生衣粗黃酮、花生衣純化黃酮的IC50分別為11.11、47.59、46.59 μg/mL。純化黃酮的抗氧化活性稍強于粗黃酮，跟其他學者的研究結果一致[16-18]。但花生衣黃酮的抗氧化活性弱于VC(P<0.05)。

圖2 黃酮清除DPPH·自由基的能力比較

表4 花生衣黃酮清除DPPH·自由基的能力

3 結論

實驗通過超聲-微波協同雙水相提取花生衣黃酮，最佳提取條件：乙醇體積分數50%、磷酸氫二鉀質量濃度140 mg/mL、液料比100∶1、微波功率為200 W、提取時間20 min，得率為22.86%；二級雙水相純化，純度可達80.17%。二級雙水相純化有利增強抗氧化活性，但花生衣黃酮的抗氧化活性弱于VC。超聲-微波協同雙水相法制備花生衣黃酮，純度高，安全便捷，本研究為花生衣的進一步資源化開發(fā)利用提供了參考。