附子-干姜對慢性潰瘍性結腸炎小鼠腸黏膜微循環障礙的改善作用

翟勇聰，夏順利，王 雪，臧凱宏, 2，韓 濤, 2*

附子-干姜對慢性潰瘍性結腸炎小鼠腸黏膜微循環障礙的改善作用

翟勇聰1，夏順利1，王 雪1，臧凱宏1, 2，韓 濤1, 2*

1. 甘肅中醫藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室，甘肅 蘭州 730000

研究附子-干姜對慢性潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）小鼠腸黏膜微循環障礙的改善作用。建立慢性UC小鼠模型，給予附子-干姜水煎液進行干預，記錄各組小鼠體質量、大便性狀及便血情況，進行疾病活動指數（disease activity index，DAI）評分；采用激光多普勒血流儀檢測各組小鼠腸黏膜血流灌注量、血細胞移動速度和移動血細胞濃度；采用ELISA法檢測各組小鼠血清中血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）和組織因子（tissue factor，TF）水平；采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察各組小鼠結腸組織病理改變情況；采用免疫組化法檢測各組小鼠腸黏膜毛細血管內皮細胞CD31表達并計算微血管密度（microvessel density，MVD）。與對照組比較，模型組小鼠DAI評分顯著增加（＜0.01），腸黏膜血流灌注量、血細胞移動速度顯著下降（＜0.01），腸黏膜移動血細胞濃度顯著升高（＜0.01），血清PAF、TF水平顯著升高（＜0.01），結腸組織CD31表達減少，腸黏膜微血管密度顯著減少（＜0.01）；與模型組比較，附子-干姜高劑量（6.06 g/kg）組小鼠DAI評分明顯降低（＜0.01），腸黏膜血流灌注量、血細胞移動速度顯著升高（＜0.01），腸黏膜移動血細胞濃度顯著降低（＜0.01），機體凝血因子PAF、TF水平顯著降低（＜0.01），腸黏膜MVD顯著增加（＜0.01）。附子-干姜可通過改善腸黏膜微循環障礙從而治療慢性UC。

附子-干姜；慢性潰瘍性結腸炎；腸黏膜；微循環；微血管密度

中醫認為慢性UC屬“泄瀉”“久痢”“休息痢”“腸癖”等范疇，病位多以大腸為主，涉及脾、胃、肝、腎等臟腑，病理因素常伴有陽虛、血虛、氣滯、血瘀等證。慢性UC病機多以脾腎陽虛為主，久病不愈、陽氣已虛致使氣血不足、血瘀腸絡，治療多加用炮姜、熟附子溫補脾腎、溫通經脈[5-8]。因此，中醫認為慢性UC與血瘀之間存在密切關系[9]。

附子為毛茛科植物烏頭Debx.的子根的加工品，具有回陽救逆、補火助陽、溫陽通脈的功效，其性剛烈迅捷、走而不守，能通上達下、行表徹里、通行十二經脈，破癥堅、積聚、血瘕等[10-13]。附子無姜不熱，常與干姜配伍使用[14]。二者配伍在臨床上常可治療慢性腸炎、克隆恩病、慢性胃炎等慢性疾病。課題組前期研究發現[15]，制附子與干姜配伍對腎上腺素所致小鼠耳廓微循環障礙具有良好的改善作用。現代藥理學研究表明，附子與干姜配伍具有改善微循環、增加血流速度、提高血流量的作用[16-17]。本研究采用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）制備慢性UC模型，觀察附子-干姜對慢性UC小鼠血清血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）、組織因子（tissue factor，TF）的水平以及腸黏膜微血管密度（microvessel density，MVD）、腸黏膜血流灌注量、血細胞移動速度、移動血細胞濃度的影響，為附子-干姜防治慢性UC腸黏膜微循環障礙提供依據。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠60只，6～8周齡，體質量20～22 g，購自甘肅中醫藥大學實驗動物中心，合格證號SCXK（甘）2015-0002，飼養于甘肅中醫藥大學實驗動物中心SPF級動物房，溫度18～22 ℃，相對濕度50%～60%。動物實驗經甘肅中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準號2019-195）。

1.2 藥材

制附子購自河北安草堂藥業有限公司，干姜購自河北百合藥業有限公司，經甘肅中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室李成義教授分別鑒定為毛茛科植物烏頭Debx.的子根的加工品、姜科植物姜Rosc.的干燥根莖。

1.3 藥品與試劑

固本益腸片（0.32 g/片，批號20191203）購自沈陽綠洲制藥有限公司；DSS（批號D7002900）購自上海翊圣生物有限公司；小鼠PAF ELISA試劑盒（批號20200909A）、小鼠TF ELISA試劑盒（批號20200909A）購自上海酶聯生物有限公司；CD31抗體（批號25u3337）購自美國Affnity公司；4%多聚甲醛通用組織固定液（批號XS190204）購自北京白鯊易科技有限公司；人尿糞隱血測定試劑盒（批號H-F01）購自南京建成生物工程研究所。

1.4 儀器

臺式電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏設備公司）；包埋機（浙江省金華市科迪儀器）；切片機、DM2500顯微鏡（德國Leica公司）；SHA-C水浴鍋（江蘇榮華公司）；iMark酶標分析儀（美國Bio Rad公司）；MoorVMS-LDF激光多普勒血流儀（英國Moor Instruments公司）；Biofuge Stratos高速冷凍離心機（美國科峻儀器公司）。

2 方法

2.1 附子-干姜提取液的制備

根據課題組前期研究[15]，附子-干姜比例為1∶1，稱取附子、干姜各100 g，附子加10倍量水浸泡1 h，先煎1 h，再與干姜合煎30 min，濾過；連續煎煮3次，合并3次濾液，于水浴鍋上濃縮至200 mL，質量濃度為1 g/mL（以生藥量計），于?20 ℃保存。

2.2 分組、造模與給藥

小鼠適應性飼養1周后，隨機分為對照組、模型組、固本益腸（1.16 g/kg）組及附子-干姜高、中、低劑量（6.06、3.03、1.51 g/kg）組，每組10只。對照組小鼠給予飲用水，其余各組連續給予2% DSS水溶液5 d，自第6天開始自由飲用水5 d，此為1個循環，如此反復進行3個循環，共30 d，建立小鼠慢性UC模型[18]。附子-干姜提取液以蒸餾水稀釋至質量濃度為0.30、0.15、0.08 g/mL的溶液，分別用作附子-干姜高、中、低劑量組；固本益腸片溶于無菌蒸餾水配制成質量濃度為0.06 g/mL的溶液。第31天各給藥組ig相應藥物（20 mL/kg），對照組與模型組ig等體積生理鹽水，1次/d，連續10 d。每天觀察各組小鼠精神狀態、飲食、飲水情況，記錄小鼠體質量、大便性狀及便血情況，進行疾病活動指數（disease activity index，DAI）評分。體質量下降率評分標準：0分為體質量不變；1分為下降1%～5%；2分為下降6%～10%；3分為下降11%～15%。大便性狀評分標準：0分為正常；2分為大便松散；4分為稀便。便血評分標準：0分為正常；2分為潛血陽性；4分為肉眼血便。

隨著我國社會經濟的快速增長，公路建設項目不斷增加,公路工程施工具有周期長、施工環境復雜以及影響因素多等特點，如果操作不當或管理不到位，會引發各種安全事故，造人員傷亡和財產損失。因此，公路工程施工安全管理是公路工程項目的重要管理內容，直接關系國家和人們的根本利益。由此可見，對公路工程施工安全管理中存在的問題進行探究有重要的意義。

DAI＝(體質量下降率評分＋大便性狀評分＋便血評分)/3

2.3 附子-干姜對慢性UC小鼠腸黏膜血流灌注量、血細胞移動速度和移動血細胞濃度的影響

小鼠末次給藥后禁食不禁水1 h，ip 4%水合氯醛麻醉，將小鼠仰臥固定于實驗臺，在腹正中線作2～3 cm切口，暴露結腸，選擇距肛門2～4 cm處為下端觀察區，4～6 cm處為上端觀察區，排除劇烈振動、心跳和呼吸對實驗的影響。在暴露腸斷面覆以紗布，用溫鹽水濕潤，然后將光纖探頭輕輕放在觀察區結腸表面，穩定5 min后進行觀測。取10 s的平均值，在檢測開始15 s時記錄血流灌注量、血細胞移動速度和移動血細胞濃度。將觀察區上下端所測得的值取平均值作為整個結腸的血流灌注量、血細胞移動速度和移動血細胞濃度值。

2.4 附子-干姜對慢性UC小鼠血清中PAF和TF水平的影響

小鼠末次給藥后禁食不禁水1 h，眼眶取血，3000 r/min離心10 min，收集血清，按照試劑盒說明書檢測小鼠血清中PAF和TF水平。

2.5 附子-干姜對慢性UC小鼠結腸組織病理變化的影響

小鼠末次給藥后禁食不禁水1 h，脫頸椎處死，取結腸組織，清洗后于4%多聚甲醛中固定48 h，脫水、常規石蠟包埋、切片，附于高黏附載玻片上，于37 ℃過夜，蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察結腸組織損傷變化。

2.6 附子-干姜對慢性UC小鼠腸黏膜MVD的影響

取各組小鼠結腸組織，清洗后于4%多聚甲醛中固定，脫水、常規石蠟包埋、切片。石蠟切片脫蠟后，加入3% H2O2阻斷內源性氧化酶并用枸櫞酸抗原修復15 min，5% BSA封閉30 min，滴加一抗（1∶100），37 ℃復蘇35 min，PBS洗滌5 min，滴加生物素化的二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌5 min；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min；DAB顯色、蘇木素復染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片后，于顯微鏡下觀察并拍照。CD31陽性表達呈棕褐色或棕黃色顆粒。在100×視野下觀察組織切片，選擇3個腸黏膜絨毛上微血管較多處，即熱點區；再于200×視野下計數熱點區微血管數目，求3個視野的平均值，作為腸黏膜絨毛組織的MVD[19]。

2.7 統計處理

3 結果

3.1 附子-干姜對慢性UC小鼠DAI評分的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組小鼠DAI評分顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組DAI評分顯著降低（＜0.01）。

3.2 附子-干姜對慢性UC小鼠結腸組織病理變化的影響

如圖1所示，與對照組比較，模型組小鼠結腸黏膜炎性細胞浸潤明顯，腺體排列損傷嚴重，層次不清，腸上皮細胞再生嚴重、淋巴組織異常增生。各給藥組小鼠結腸組織結構趨于完整，杯狀細胞明顯增多，炎性細胞浸潤明顯減少，腺體結構趨于完整，增生組織明顯較少。

3.3 附子-干姜對慢性UC小鼠腸黏膜血流灌注量、血細胞移動速度和移動血細胞濃度的影響

如表2所示，與對照組比較，模型組小鼠腸黏膜血流灌注量、血細胞移動速度顯著下降（＜0.01），移動血細胞濃度顯著升高（＜0.01）。與模型組比較，固本益腸組、附子-干姜高劑量組小鼠腸黏膜血流灌注量、血細胞移動速度顯著升高（＜0.01）、移動血細胞濃度顯著下降（＜0.01）；附子-干姜中劑量組小鼠腸黏膜血流灌注量、移動血細胞速度顯著升高（＜0.05）。

表1 附子-干姜對慢性UC小鼠DAI評分的影響()

與對照組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

##<0.01control group;*<0.05**<0.01model group, same as below tables

圖1 附子-干姜對慢性UC小鼠結腸組織病理變化的影響(HE, ×100)

3.4 附子-干姜對慢性UC小鼠血清中PAF和TF水平的影響

如表3所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中PAF和TF水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中PAF和TF水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.5 附子-干姜對慢性UC小鼠腸黏膜MVD的影響

如圖2所示，CD31陽性表達均定位于血管內皮細胞胞質，呈棕褐色顆粒或棕黃色。對照組小鼠腸黏膜結構清晰，CD31表達陽性的棕褐色顆粒分布于腸絨毛的中軸，數量較多；模型組小鼠腸黏膜結構及腸絨毛可見邊緣缺損，炎性細胞浸潤明顯，CD31表達陽性的棕褐色顆粒在腸絨毛的中軸分布不均，顆粒較少；各給藥組小鼠腸黏膜可見較多的棕褐色顆粒。

如表4所示，與對照組比較，模型組小鼠腸黏膜MVD顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，固本益腸組及附子-干姜高、中劑量組小鼠腸黏膜MVD顯著升高（＜0.05、0.01）。

表2 附子-干姜對慢性UC小鼠腸黏膜血流灌注量、血細胞移動速度和移動血細胞濃度的影響()

表3 附子-干姜對慢性UC小鼠血清中PAF和TF水平的影響()

圖2 附子-干姜對慢性UC小鼠腸黏膜毛細血管內皮細胞CD31表達的影響(×400)

表4 附子-干姜對慢性UC小鼠MVD的影響()

4 討論

UC是消化系統中最常見的一種慢性疾病，常自結腸近端發展至全結腸導致黏膜損傷[20]。慢性UC患者5年內結腸切除的風險為10%～35%，我國UC的患病率為0.011 6%[21-22]。目前臨床上主要以5-氨基水楊酸藥物、類固醇類、免疫抑制劑、生物制劑等基本藥物聯合肝素維持治療慢性UC，但因聯合用藥復雜，治療效果不佳，UC復發率極高、不良反應較多。因此，尋找更為有效的治療UC藥物尤為重要。中醫藥通過辨證治療慢性UC，具有不良反應小的優點[23]。近年來有應用中藥復方、中藥單味藥聯合西藥或者僅通過針刺改善微循環而治療UC的相關報道[24-26]，但因其復方藥味復雜，改善微循環機制不明確或者針刺治療方式單一，近期癥狀緩解效果良好，但遠期療效不佳。附子-干姜來源于《三因極一病證方論》中的附子理中湯，具有溫中散寒、補氣健脾的功效，主治久病不愈、寒凝不化、腸鳴即瀉等癥，方中發揮主要作用的附子-干姜具有抗潰瘍、抗炎、改善微循環等作用。

中醫認為“瘀”是UC的主要病因病機，病理基礎以脾腎陽虛為本、以“瘀”為標，表明UC病程較長，纏綿難愈，久病必有瘀，血瘀的產生必然加重UC的病情和復雜性[27-28]。久瀉傷腎則腎陽不足，脾陽無以溫煦，氣血瘀滯，化腐成膿，故導致腹痛、黏液膿血便。因此，可以用附子-干姜補腎陽間接化瘀從而改善脾腎陽虛、瘀血阻滯，從本質上治療慢性UC。本研究結果顯示，附子-干姜可改善慢性UC小鼠皮毛光澤度、飲食飲水量及弓背、膿血便等癥狀，提示附子-干姜在改善慢性UC的臨床癥狀中具有明顯的優勢。

腸黏膜局部的血液循環是黏膜局部防衛能力的重要組成部分。良好的血液循環，是提供豐富的營養和祛除有害代謝物質的重要保證，對黏膜的完整性起重要作用[29]。目前，腸黏膜微循環障礙是慢性UC臨床研究中的熱點。慢性UC疾病使機體凝血系統異常、炎癥活化、凝血功能障礙，腸黏膜微血栓形成，腸黏膜血流灌注量減少，加重腸黏膜組織缺血、壞死，形成潰瘍，出現便血癥狀[30-31]。腸道炎癥可引起機體的抗凝系統紊亂、血小板功能改變，導致腸黏膜及其他部位血栓的形成。慢性UC腸黏膜活檢病理組織學中常見大量黏膜毛細血管血栓形成[32]。血栓形成使腸黏膜通透性改變，腸黏膜供血減少，使腸腔內的有害物質進入血循環，黏膜毛細血管破壞，進而使腸黏膜受損，誘導黏膜發生異常炎癥反應[33]。慢性UC炎癥狀態可通過局部釋放血小板活化物（如TF、PAF）并激活其他炎癥細胞，使血液呈血栓狀態，阻塞腸黏膜微循環，加重腸黏膜缺氧損傷，形成惡性循環，使慢性UC反復發作[34]。化學趨化物PAF在局部微循環障礙病理過程中起重要作用[35]。PAF的主要作用是刺激血小板，促進血小板聚集，引起中性粒細胞聚集，增加血管通透性，加劇炎癥發生[36]。TF在生理性止血和血栓形成中起著重要的作用。在某些誘因作用下凝血系統TF從內皮細胞釋放，與凝血因子結合形成復合物后被活化，誘發機體血液呈高凝狀態[37]。TF在慢性UC結腸組織中呈高表達水平[38]。因此，PAF、TF可作為檢驗炎癥狀態下機體是否有凝血狀態的指標。本研究結果顯示，附子-干姜可顯著降低慢性UC小鼠血清中PAF和TF水平，減少慢性UC機體血栓的形成。機體微血栓形成會使腸黏膜組織微循環血流灌注量減少，血細胞移動速度減慢直至停止，移動血細胞濃度上升，因此血流灌注量、血細胞移動速度、移動血細胞濃度是了解組織微循環狀態的重要指標[39]。移動血細胞濃度與組織中細胞的數量有關，可反映血細胞的聚集程度。血細胞移動速度是微循環的實時動態，可反映微循環血流灌注量的情況。血流灌注量與血流速度呈正比，血流灌注量的降低主要由血流速度變慢、移動血細胞濃度增高造成[40]。激光多普勒血流儀是微循環血流測量中無創、敏感、重復性較好的檢測設備，可以實時動態觀察血流的變化[41-43]。本研究結果顯示，附子-干姜能顯著改善慢性UC小鼠腸黏膜移動血細胞濃度，加快血流速度，減少紅細胞聚集，提高腸黏膜微循環血流灌注量影響。腸黏膜微循環血流灌注量減少，就會使腸黏膜功能毛細血管破壞。CD31是一種血小板內皮細胞黏附分子，可以準確地標記新生微血管的數目和密度[44]。本研究結果顯示，慢性UC狀態下腸黏膜MVD顯著降低，附子-干姜高劑量組小鼠腸黏膜MVD顯著增加，表明附子-干姜能夠保護腸黏膜功能毛細血管內皮細胞，增加腸黏膜功能毛細血管密度。

綜上，本研究發現附子-干姜能夠降低機體凝血系統的紊亂，保護慢性UC腸黏膜毛細血管內皮細胞，增加腸黏膜毛細血管密度，增加腸黏膜血流灌注量，加快血細胞移動速度，降低移動血細胞濃度，促進腸黏膜修復，改善腸黏膜微循環障礙。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of-on intestinal mucosal microcirculation in mice with chronic ulcerative colitis

ZHAI Yong-cong1, XIA Shun-li1, WANG Xue1, ZANG Kai-hong1, 2, HAN Tao1, 2

1. School of Pharmacy, Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China 2. Gansu Key Laboratory for TCM Pharmacology and Toxicology, Lanzhou 730000, China

To study the effect of Fuzi ()-Ganjiang () on intestinal mucosal microcirculation disorder in mice with chronic ulcerative colitis (UC).Mice model of chronic UC was established, and-decoction was given to intervene. Body weight, stool characteristics and blood in stool were recorded, disease activity index (DAI) score was performed. Laser Doppler Blood Flow Meter was used to detect intestinal mucosal blood perfusion, blood cell movement speed and mobile blood cell concentration. ELISA method was used to detect platelet activating factor (PAF) and tissue factor (TF) levels in serum. Pathological changes of colon tissue were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining. Immunohistochemical method was used to detect the expression of CD31 in intestinal mucosal capillary endothelial cells of mice and the microvessel density (MVD) was calculated.Compared with control group, DAI score of mice in model group was significantly increased (< 0.01), intestinal mucosal blood perfusion and blood cell moving speed were significantly decreased (< 0.01), the concentration of moving blood cells in intestinal mucosa was significantly increased (< 0.01), PAF and TF levels in serum were significantly increased (< 0.01), CD31 expression in colon tissue was reduced, and intestinal mucosal microvessel density was significantly reduced (< 0.01). Compared with model group, DAI score of mice in high-dose (6.06 g/kg)-group was significantly reduced (< 0.01), intestinal mucosal blood perfusion and blood cell moving speed were significantly increased (< 0.01), concentration of moving blood cells in intestinal mucosa was significantly reduced (< 0.01), and coagulation factor PAF and TF levels in serum were significantly reduced (< 0.01), MVD of intestinal mucosa was significantly increased (< 0.01).-can treat chronic UC by improving intestinal mucosal microcirculation.

-; chronic ulcerative colitis; intestinal mucosa; microcirculation; microvessel density

R285.5

A

0253 - 2670(2021)07 - 1987 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.016

2020-11-24

國家自然科學基金地區基金資助項目（81860728）

翟勇聰（1994—），女，碩士研究生，從事中藥及復方應用研究。Tel: 13466865255 E-mail: 735451739@qq.com

韓 濤（1966—），男，教授，碩士生導師，從事中藥及復方應用研究。Tel: 13919446101 E-mail: zggsht@126.com

[責任編輯 李亞楠]