基于夏枯草不同生長發育時期化學成分的動態監測闡釋“夏枯質優”的科學內涵

劉月新，林 艷，謝菁琛，張智敏，廖穎妍，夏伯候*，林麗美

基于夏枯草不同生長發育時期化學成分的動態監測闡釋“夏枯質優”的科學內涵

劉月新1, 2，林 艷1, 2，謝菁琛1, 2，張智敏1, 2，廖穎妍1, 2，夏伯候1, 2*，林麗美1, 2

1. 湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208 2. 湘產大宗藥材品質評價湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208

基于紫外（UV）和高效液相（HPLC）全息指紋圖譜，化學模式識別技術與多成分定量相結合的方法，整合評價不同生長發育時期的49批夏枯草樣品化學成分的變化規律，從而闡明夏枯草由草到藥的演變過程，解釋夏枯草“夏枯質優”的科學內涵。建立不同生長發育時期49批夏枯草樣品的UV和HPLC全息指紋圖譜，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法-判別分析（partial leastsquares-discriminant analysis，PLS-DA）對其進行評價，篩選出影響夏枯草分類的特異性吸收波段，并對主要差異性化學成分進行含量測定。建立了不同生長發育時期49批夏枯草樣品的UV和HPLC指紋圖譜，PCA和PLS-DA分析可直觀顯示夏枯草樣品中總的化學組分在不同生長發育時期時動態的變化趨勢，其中夏枯草枯萎期可以明顯的和其他4個時期區分開來，且其他4個時期有向枯萎期動態漸變的趨勢。UV指紋圖譜通過PLS-DA 篩選出特異性吸收波段為261 nm，HPLC指紋圖譜利用PLS-DA的變量因子（VIP）分布圖，篩選出VIP值大于1.3的2個色譜峰，經指認為異迷迭香酸苷和迷迭香酸，確定為主要差異性化學成分。對不同生長發育時期的夏枯草差異性化學成分進行含量測定，其中迷迭香酸的含量為0.020%～0.344%；異迷迭香酸苷的含量為0.0016%～0.0988%。多成分定量結果說明，果穗枯萎期中異迷迭香酸苷和迷迭香酸的含量明顯增加。含量測定結果與指紋圖譜模式識別結果一致，兩者可相互驗證。指紋圖譜結合化學模式識別技術與多成分定量，多種分析方法并用，全方位整合的技術手段，實現了對夏枯草從草到藥的整個生長發育過程中整體化學信息的動態監測。該方法分析全面、操作簡便，為闡明“夏枯質優”，規范夏枯草藥材采收及全面評價藥材質量提供參考。

夏枯草；紫外指紋圖譜；高效液相指紋圖譜；主成分分析；偏最小二乘法-判別分析；異迷迭香酸苷；迷迭香酸；多成分定量

幾千年來，中草藥一直被中國人民用作防治疾病的主要工具，日漸積累寶貴的用藥知識，并形成一整套中藥理論體系。中藥材與采收時節密切相關。民間就有這樣的俗語：“當季是藥，過季是草”，“三月茵陳四月蒿，五月六月當柴燒”，因此，中藥在適宜的時間采收，直接影響防病治病的效果。

為何中藥一定要到它的最佳采收期采收才可用藥？中藥作為多組分、多靶點的復合體系，用其中的某一種組分或某一類組分來判定采收時期，很難從整體上評價其結果，因此，本實驗以夏枯草為例，借助多維指紋圖譜，以及化學計量學等多元數據統計分析的方法[1-3]，建立整合模型，研究總的化學組分在夏枯草生長不同時期的動態變化過程，從整體上闡明總的化學組成與不同生長發育時期之間的關系，以科學的手段解釋夏枯草“夏枯質優”的科學內涵，它是如何從草到藥的。

夏枯草為唇形科（Lamiaceae）植物夏枯草L.的干燥果穗，具有清肝散火、明目、散結消腫的功效[4-5]。其藥用部位為果穗，應在植株果穗80%現黃漸變成棕褐色時，趁晴天可擠蔸割下或將果穗割回曬干收籽，其表型變化過程明顯。

中藥從屬于復雜科學體系，任何單一方法都無法清晰準確揭示中藥復雜系統的真實本源，主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）目前廣泛應用于藥品食品和農產品等的快速識別。本實驗以夏枯草為研究對象，研究“夏枯”前后化學成分變化的差異性。利用2種指紋圖譜實現了對中藥全化學成分的全面監測，并將多維指紋譜技術和多元數據分析技術恰當整合，使其成為一種綜合鑒別、客觀量化和精準評價中藥的有效可行方法，使中醫中藥在中藥質量控制、中藥藥效成分研究、中藥作用機制研究等多方面更加科學化[6-7]。

1 材料

1.1 儀器與試劑

TU-1900雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；Alliance Waters e2695高效液相色譜系統，AllianceWaters 2998PDA檢測器，Empower3色譜工作站（Waters公司）；KQ-500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SQP型電子分析天平（賽多利科學儀器北京有限公司）；所用試劑甲醇、甲酸均為色譜純；水為超純水；對照品蘆丁（批號B20771）海源葉生物科技有限公司）；異迷迭香酸苷、迷迭香酸均為課題組自制，質量分數經高效液相色譜法（面積歸一化法）測定大于98%。

1.2 試藥

1.2.1 夏枯草種植 湖南中醫藥大學藥植園（112°54′E；28°08′N；88 m），土壤為砂質黃土壤，肥力中等。播種前施入有機復合肥1.2×103kg/hm2作為底肥一次性施入土壤。

1.2.2 夏枯草采收 對夏枯草生長階段進行劃分，依次分為生長期（A1～A5）、花始期（B6～B16）、花盛期（C17～C24）、花萎期（D25～D37）和枯萎期（E38～E49）5個時期，采集各個時期樣本共49份，藥材經湖南中醫藥大學藥學院王智教授鑒定為唇形科夏枯草屬植物夏枯草L.。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 紫外用供試品溶液的制備 精密稱取夏枯草藥材粉末（過40目篩）約0.1 g，加入溶劑2 mL，密塞，稱定質量，超聲提取60 min，放冷，再稱定質量，用溶劑補足減失的質量，搖勻，靜置后取上清液0.5 mL，微孔濾膜（0.45 μm）濾過，定容至8 mL。即得各樣品紫外指紋圖譜的待測溶液。

2.1.2 HPLC用供試品溶液的制備 精密稱取49份夏枯草粉末（過40目篩）約0.2 g，加入溶劑5 mL，密塞，稱定質量，超聲提取（50 ℃、60 min），放冷，再稱定質量，用溶劑補足減失的質量，搖勻，靜置后取上清液，微孔濾膜（0.22 μm）濾過，即得各樣品高效液相指紋圖譜的待測溶液。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取異迷迭香酸苷對照品5.20 mg、蘆丁對照品2.72 mg、迷迭香酸對照品4.48 mg，分別置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得各對照品質量濃度分別為0.520、0.272、0.448 mg/mL。分別取異迷迭香酸苷溶液、蘆丁溶液、迷迭香酸溶液100、10、500 μL置1 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，3個對照品混合溶液質量濃度分別為52.00、2.72、224.00 μg/mL。

2.3 夏枯草紫外指紋圖譜的建立

按照“2.1.1”項下方法制備49批夏枯草樣品的供試品溶液，依次置于1 cm石英比色皿中，以40%甲醇溶劑作為參比溶液，進行紫外光譜掃描。測定波長范圍200～800 nm，狹縫寬度1.0 nm，采樣間隔1 nm，采樣重復次數3次。結合UV Win6.0軟件在200～800 nm內進行監測，分辨率為1 nm，獲得600個點樣。

紫外光譜進行3組平均，4點平滑，一階求導處理，以校準基線和強化譜帶特征，克服譜帶重疊，使圖譜信息清晰直觀。利用PCA、PLS-DA進行多元統計分析，PLS-DA的VIP得分圖分析標志性波段，篩選出區別較大的波數。以此作為檢測波長，對樣品進行高效液相色譜分析。

2.4 夏枯草高效液相指紋圖譜的建立

2.4.1 指紋圖譜色譜條件 色譜柱：Agilent 5HC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫條件為0～10 min：8%～16%A；10～30 min：16%～50%A；30～40 min：50%～75%A；40～45 min：75%～100%A；檢測波長261 nm；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min；進樣量10 μL。

2.4.2 高效液相指紋圖譜建立 按照“2.1.2”項下方法制備49批夏枯草供試品溶液，按照“2.4.1”項下色譜條件對樣品依次進行檢測，記錄指紋圖譜，采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2004A版）建立49批夏枯草共有模式圖譜，并進行相似度分析，以及PCA、PLS-DA多元統計分析。

2.5 數據處理與多元統計分析

2.5.1 PCA PCA可被視為“多變量數據分析中所有方法的母親”。PCA的目標是降維，是計算線性潛變量（組分）的最常用方法。它可從原始變量之間的相互關系入手，利用方差最大原則，通過放大原始數據中的差異性，并將它們線性轉換到主成分上。然后通過對主成分作圖，能夠直觀的描述各主成分的差別。它是一種非監督的模式識別方式，反映數據的原始情況，有利于對數據從整體上進行評價。為了便于觀察不同生長發育時期的夏枯草之間的差異性，在不損失大量信息的條件，利用PCA將高維的紫外、液相指紋圖譜數據轉化為低維的數據。所有的數據導入SIMCA 14.1進行聚類分析。

2.5.2 PLS-DA PLS-DA是有監督的模式識別方式，可彌補PCA模式的不足，凸顯組間差異。2種模式互為補充。目前已成為一種常用于代謝組分學的分析方法，它可以通過最大自變量數據和應變量數據集之間的協方差來構建正交得分向量（潛變量或主成分），從而擬合自變量數據和應變量數據之間的線性關系。PLS-DA模型的擬合效果通常通過2、2、2這3個指標來評價，這些指標大于0.5較為可信，并且越接近1說明PLS-DA模型的擬合效果越好[8-10]。

為了將各不同生長發育時期的夏枯草更好地進行分類，采用PLS-DA進行紫外、液相的指紋圖譜分析。其中液相指紋圖譜數據在PLS-DA分析的基礎上，根據VIP＞1.3、＜0.05的變量來篩選導致差異性的主要化學成分。

2.6 特征成分的含量測定

分別取49批夏枯草樣品進行含量測定，計算樣品中篩選出的導致差異性主要化學成分的含量。從成分定量的角度來說明夏枯草從草到藥，即“夏枯質優”的科學內涵。

2.6.1 色譜條件 色譜柱：Agilent 5HC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫條件為0～10 min，12%～30%A；10～15 min，30%～35%A；15～25 min，35%～48%A；25～30 min，48%～60%；30～40 min，60%～70%A；40～45 min，70%～100%A。檢測波長261 nm，柱溫30 ℃，體積流量1 mL/min，進樣量10 μL。

2.6.2 精密度試驗 按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.6.1”項下色譜條件，供試品溶液連續進樣6次，以迷迭香酸峰（12號峰）為參照峰，計算相對保留時間及相對峰面積，RSD值應小于3%。

2.6.3 重復性試驗 按“2.1.2”項下方法制備6份供試品溶液，進行HPLC分析，以迷迭香酸峰（12號峰）為參照峰，計算相對保留時間及相對峰面積，RSD值應小于3%。

2.6.4 穩定性試驗 取同一份藥材供試品溶液，在0、2、4、8、12、24 h分別測定，計算相對保留時間及相對峰面積，RSD值應小于3%。

3 結果與分析

3.1 紫外指紋圖譜的多元統計分析結果

3.1.1 紫外指紋圖譜分析 將49批夏枯草樣品待測溶液依次掃描，記錄200～800 nm在線紫外光譜圖，樣品在400～800 nm吸收很低，因此確定提取紫外指紋圖譜在200～400 nm，這部分以反映夏枯草中主要紫外吸收物質特征。結合UV Win6.0軟件在200～400 nm內進行監測，分辨率為1 nm，獲得200個點樣數據。將所得數據導入Origin2017數據分析軟件中，紫外指紋圖譜如圖1-A所示。可以看出，在200～250 nm、250～300 nm、300～400 nm紫外吸收信號較強，提示可能分別是三萜類、黃酮類、酚酸類成分的紫外光譜特征。其中三萜類成分可能為熊果酸和齊墩果酸，黃酮類可能為蘆丁、蕓香苷等，酚酸類成分可能為迷迭香酸、咖啡酸等。圖1-A的紫外指紋圖譜經過Savitzky-Golay平滑再經過一階導數轉換（first derivative），結果如圖1-B所示。紫外指紋圖譜能夠觀察到夏枯草中所有的化學成分信息，不同生長時期樣品的紫外指紋圖譜特征區（200～400 nm）峰型和吸收強度存在差異，共有峰提示不同個體樣品主要成分組成相似，吸收強度差異提示樣品之間主要成分含量存在差異，圖中可以看出，枯萎期的樣品圖譜和其他4個時期比較，無論化學成分組成或是主要成分含量，都存在較為明顯的差異，圖1-B較圖1-A差異性更為顯著。但紫外指紋圖譜中峰形和吸收值差異卻不能明顯觀察到各個生長發育時期樣品中化學成分的變化過程。故需要對指紋圖譜進行多元統計數據分析，以區別不同生長發育時期的樣品。將紫外指紋圖譜數據導入SIMCA 14.1軟件進行PCA分析、PLS-DA分析。

3.1.2 PCA分析結果 為了觀察不同生長時期夏枯草之間的差異性，49批樣品所得的數據導入SIMCA 14.1進行PCA分析，從PCA得分圖可以直觀看出，夏枯草不同生長發育時期基本上分成5類，分類結果如圖2-A所示。建立的模型累計解釋參數2＝0.987，預測能力的參數2＝0.964，2＞0.5，說明該模型的區分程度和預測程度都較好，且結果在95%置信區間內分類結果可信。此外，除枯萎期外的四個時期，依次從生長期、花始期、花盛期、花萎期化學成分有明顯的漸變趨勢，說明夏枯草中總的化學成分是從生長期開始，逐漸向枯萎期動態演變，最終形成突越，使得枯萎期可以明顯的和其他四個時期區分開來，由此說明夏枯草生長期、花始期、花盛期、花萎期，即為“成草期”，歸為一類，最終成為可藥用的枯萎期，即為“成藥期”，歸為另一類，說明它從“草”到藥的演變過程。

A-夏枯草樣品紫外原始指紋圖譜 B-夏枯草樣品紫外一階導數圖譜

3.1.3 PLS-DA分析結果 為了更好地將各不同時期的夏枯草進行區分，另采用偏最小二乘法-判別分析方法進行進一步分析，PLS-DA分析結果如圖2-B所示。前2主成分2＝0.949，2＝0.523，且結果在95%置信區間內說明分類結果可信。PLS-DA得分圖直觀顯示了49批不同生長時期的夏枯草樣品中所含化學成分的動態變化過程。分類結果與PCA分析結果大體相似，以中間軸為界，所有樣品大致被分為2類，左邊為“成草期”，右為“成藥期”。

3.1.4 PLS-DA模型篩選標志性波段 通過PLS-DA變量重要性因子（Variable important for the projection，VIP）分布圖分析，篩選出49份夏枯草樣品中紫外指紋圖譜區別較大的標志性波長，VIP值可以量化PLS-DA的每個變量對分類的貢獻，VIP值越大，變量在夏枯草不同生長時期的差異越顯著。如圖2-C所示，因溶劑吸收區在190～210 nm，干擾較大，觀察發現261 nm處干擾較小，VIP值最大，VIP＞1.6，故選261 nm作為高效液相指紋圖譜的檢測波長，如圖2-C所示。

3.2 高效液相指紋圖譜多元統計分析結果

3.2.1 高效液相指紋圖譜的建立 采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2004A版）建立49批夏枯草共有模式圖譜，結果見圖3-A。

選取時間寬度為0.1 min，以平均數生成對照色譜圖，經過多點矯正后自動匹配，確定13個特征峰作為評價的變量指標。并用混合對照品進行指認，確定10、11、12號峰分別為蘆丁、異迷迭香酸苷和迷迭香酸，結果如圖3所示。

A-夏枯草紫外PCA得分圖 B-夏枯草紫外PLS-DA得分圖 C-PLS-DA模型VIP圖

以上述共有模式為對照指紋圖譜，對49批夏枯草的指紋圖譜進行相似度評價，夏枯草的相似度在0.24～1.00，表明不同生長發育時期夏枯草相似度較低，差異較大，將相似度評價結果采用熱點圖形式呈現，如圖4所示。（顏色差異大說明相似度差異大，顏色偏藍偏紫的部分說明相似度較小），為更好的進行分類，需進一步采用其他化學模式識別方法[11]。

采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2004A版）分析夏枯草HPLC指紋圖譜數據，以共有峰峰面積為變量，將數據導入SIMCA 14.1軟件進行PCA、PLS-DA分析。

3.2.2 PCA分析結果 為了觀察不同時期夏枯草之間的差異性，從PCA得分圖可知，夏枯草不同生長發育時期能基本分為5類，分類結果如圖5-A所示。建立的模型累計解釋參數2＝0.773，預測能力的參數2＝0.512，說明該模型的區分程度和預測程度都較好。結果與紫外指紋圖譜分析結果一致，可以看出，依次從生長期、花始期、花盛期、花萎期化學成分有明顯的動態漸變趨勢，最終的枯萎期則可以明顯的和其他4個時期區分開來，這個動態漸變趨勢與紫外指紋圖譜的分析結果一致。

3.2.3 PLS-DA分析結果 對不同生長發育時期夏枯草高效液相指紋圖譜結果進一步進行PLS-DA分類分析。分類結果如圖5-B所示，前2主成分2＝0.744，2＝0.541，說明分類結果較為可信，PLS-DA得分圖中的每一個點代表每一個樣品，復雜的譜圖信息在PLS-DA得分圖中能直觀顯示不同生長發育時期和樣品之間的關系，圖譜相似的樣品聚在較近區域，圖譜差異大的樣品聚在較遠區域，圖中枯萎期的樣品與其他4個時期的樣品差異性較大，因此聚在較遠區域，而夏枯草的生長期、花始期、花盛期、花萎期，4個“成草期”的樣品差異性較小，相互貼近，聚在較近的區域，并且有向枯萎期轉變的漸變趨勢。圖中直觀展現了夏枯草從草到藥的演變歷程。PCA和PLS-DA分析結果互為補充，相互驗證，所得結果具有科學客觀性。

10-蘆丁 11-異迷迭香酸苷 12-迷迭香酸

圖4 夏枯草相似度評價結果

A-夏枯草液相PCA得分圖 B-夏枯草液相PLS-DA得分圖 C、D-VIP標志物差異圖

本實驗繼續運用PLS-DA方法進一步分析。根據VIP＞1.3、＜0.05的變量來篩選導致差異性的主要化學成分，提取PLS-DA模型中13個變量的VIP值，對13個共有峰峰面積VIP值大小進行排列，結果如圖5-C、5-D所示，選擇VIP值大于1.3的共有峰，依次為12號峰（VIP值：1.564 1）、11號峰(VIP值：1.327 1)，說明以上化學成分對夏枯草樣品分類具有顯著的影響，這些成分是引起不同生長時期的夏枯草成分差異的主要標志性成分。經過對照指認，確認11號峰為異迷迭香酸苷，12號峰為迷迭香酸，10號峰為蘆丁，而10號峰并未出現在VIP＞1.3的色譜峰中，則提示它并不是夏枯草不同時期內在成分差異的主要物質基礎。

3.3 方法學考察

3.3.1 精密度試驗 按“2.6.2”項下方法考察儀器精密度。結果顯示，各色譜峰相對保留時間的RSD為0.45%，各色譜峰相對峰面積的RSD為1.23%，均小于3%，說明儀器精密度良好。

3.3.2 重復性試驗 按“2.6.3”項下方法考察方法的重復性。結果顯示，各色譜峰相對保留時間的RSD為0.27%，各色譜峰相對峰面積的RSD為2.23%，均小于3%，說明該方法的重復性良好。

3.3.3 穩定性試驗 按“2.6.4”項下方法考察供試品溶液的穩定性。結果顯示，各色譜峰相對保留時間的RSD為0.58%，各色譜峰相對峰面積的RSD為2.42%，均小于3%，說明夏枯草供試品溶液在24 h內穩定性良好。

3.4 特征成分的含量測定

對“2.2”項混合對照品按“2.6.1”項下色譜條件進樣，進樣量分別為1、2、4、6、8、10 μL，記錄峰面積。以2種成分的質量為橫坐標（）和峰面積為縱坐標（）進行標準曲線回歸，得異迷迭香酸苷標準曲線方程和線性范圍為＝213 600－1 945.7，線性范圍為0.052～0.520 μg,2＝0.999 7；迷迭香酸標準曲線方程和線性范圍為＝264 756－8 535.1，線性范圍為0.004 4～0.140 8 μg,2＝0.999 7。以標準曲線為參照，對夏枯草不同時期2種成分含量進行測定，結果見表1。

夏枯草活性成分隨著植物的生長不斷發生變化，其中異迷迭香酸苷和迷迭香酸2個活性成分占據主導作用。為進一步分析2種活性成分在夏枯草生長過程中變化規律，采用HPLC法對其進行含量測定，結果顯示，異迷迭香酸苷隨著果穗的不斷枯萎，其含量明顯增加，枯萎期含量最高，異迷迭香酸苷的含量為0.001 6%～0.098 8%（＜0.01）；迷迭香酸含量在夏枯草枯萎前期較低，隨著果穗不斷的枯萎，其含量變化明顯，到枯萎期含量達到最高，迷迭香酸的含量為0.02%～0.344%（＜0.01）。

表1 夏枯草不同時期2種成分含量變化

**＜0.01，顯著性差異

**< 0.01, significant difference

自夏枯草列入《中國藥典》以來，迷迭香酸含量一直作為夏枯草質控標準，《中國藥典》2015年版規定迷迭香酸含量不得低于0.2%，這說明只有當夏枯草完全枯萎時，其藥效方能達到標準，這對“夏枯質優”進行了闡釋，也對夏枯草的栽培采收提供參考依據。上述迷迭香酸和異迷迭香酸苷含量測定結果與指紋圖譜模式識別結果一致，兩者可相互驗證。

4 討論

夏枯草的主要藥效成分較為復雜，不同極性溶劑提取的成分組成和含量存在差異。本實驗對樣品的提取溶劑、溶劑濃度、提取時間進行考察，以A1樣品為分析對象，準確稱取0.100 0g樣品3份，分別加入超純水、甲醇和乙醇，超聲提取，方法同“2.3”項。依次測定紫外光譜圖。考查不同提取溶液的吸收峰數目，吸收強度，確定最佳提取溶劑。最終采用40%甲醇超聲提取60 min作為前處理方法。該條件下所得峰的數量較多，且操作簡便。

中藥指紋圖譜分析方法大多數以色譜指紋圖譜為主，近年來，由于中藥提取液中包含整體化學物質組分，光譜指紋圖譜更能從宏觀、整體上清晰提供所含全部化學成分方面的信息。其中紫外光譜能夠反映樣品中所有不飽和化學鍵（如雙鍵、三鍵、共軛體系及助色團）的特征規律信息，依據峰形、收波長和吸光度的不同，結合化學計量學方法探討供試樣品的差異，在中藥鑒別方面應用較為廣泛[11-14]。再加上其樣品前處理簡單、分析時間較短，檢測成本低廉等特點受到廣大分析工作者的日益關注。因此光譜指紋圖譜可以輔助色譜指紋圖譜從整體上實現對中藥的科學化研究和評價。

指紋圖譜技術結合化學計量學能有效地區別不同生長發育時期夏枯草樣品，其中PCA分析可以實現將大量的變量降維成二維空間數據，降低觀測空間的維數，以獲取最主要的信息，通常可以通過少數幾個主成分即可最大限度地描述數據特點，對樣品加以區分。復雜的紫外光譜圖信息和液相色譜圖信息可以在PCA和PLS-DA得分圖中直觀顯示夏枯草樣品中總的化學組分在不同生長時期時動態的變化過程，夏枯草枯萎期可明顯和其他時期區分開來，說明枯萎期所包含化學成分無論從組成或是含量都發生了質的改變，由此闡明夏枯草“夏枯質優”的科學內涵，它是如何從草到藥的。

《中國藥典》2015年版規定的夏枯草質量控制組分為迷迭香酸，檢測波長為330 nm，而本研究的液相指紋圖譜檢測波長是在紫外指紋圖譜指導下，通過PLS-DA變量重要性因子VIP分布圖篩選出區別較大的標志性波長，即261 nm。藥典中是以單一組分作為質量控制的標準，但中藥本身是個多種成分的集合體，以單一組分控制中藥質量并不全面，本實驗是把夏枯草中所有化學組分看作一個整體，收集49批不同生長發育時期夏枯草樣品，并通過紫外指紋圖譜、高效液相指紋圖譜與PCA、PLS-DA模式識別方法相結合，以及對差異性成分定量的方法，來比較不同時期夏枯草樣品的差異性。從而闡明夏枯草由草到藥的演變過程。同時，本實驗多了一個質控標準的參考檢測波長261 nm，對于完善夏枯草的質量控制標準具有一定參考意義，目前，由于采收不同時期的時間較短，收集的夏枯草各個時期的樣品批次還相對較少，后續實驗可以增加樣品批次，細化不同時期采收的時間、方法，不斷修正夏枯草的特征圖譜。

目前對夏枯草的研究較為片面，主要集中在其果穗枯萎階段。以往文獻對不同生長發育時期夏枯草化學成分變化規律的研究也只局限于一、兩個或幾大類成分為指標，難以全面反映夏枯草次生代謝產物累積變化規律。本課題以夏枯草為研究對象，從整個植物動態發育角度進行分析，從整體上闡明總的化學組成與夏枯草不同生長時期之間的關系，跟蹤整個生長發育過程，以科學的手段解釋夏枯草“夏枯質優”的科學內涵，該方法分析全面、操作簡便，為規范夏枯草藥材采收及藥材科學、合理加工方法的確定提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 夏伯候, 熊蘇慧, 唐潔, 等. 基于多元統計分析的夏枯草多重藥效物質與抗氧化活性分析 [J]. 中國中藥雜志, 2018, 43(23): 4645-4651.

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Scientific connotation of “summer withering with good quality” based on dynamic monitoring of chemical constituents at different growth and development stages of

LIU Yue-xin1, 2,LIN Yan1, 2, XIE Jing-chen1, 2,ZHANG Zhi-min1, 2, LIAO Ying-yan1, 2, XIA Bo-hou1, 2,LIN Li-mei1, 2

1. School of Pharmacy, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2. Hunan Key Laboratory for Quality Evaluation of Bulk Herbs, Changsha 410208, China

Based on the UV and HPLC fingerprints ofsamples, combined with multi-component quantitative analysis and chemical pattern recognition methods, the changes of chemical components in 49 batches ofsamples at different growth stages were evaluated, so as to clarify the evolution process offrom herbs to medicines, and explain the scientific connotation of “summer withering with good quality” of.UV and HPLC holographic fingerprints of 49 batches ofsamples at different growth stages were established, which were evaluated by principal component analysis (PCA) and partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA). The specific absorption bands affecting the classification ofwere screened out. The chemical constituents that cause the difference ofat different growth and development stages were determined.UV and HPLC fingerprints of 49 batches ofsamples at different growth stages were established. PCA and PLS-DA analysis intuitively showed the dynamic changes of total chemical components insamples at different growth stages. The withering period ofcan be clearly distinguished from the other four periods, and the other four periods had a trend of dynamic gradual change towards the withering period. The specific absorption band of UV fingerprint was 261 nm through PLS-DA. By using the VIP distribution map of PLS-DA, two peaks with VIP value greater than 1.3 were screened out by HPLC fingerprint. Isorosmarin and rosmarinic acid were identified as the main differential chemical components. Determination of chemical components ofin different growth stages was carried out, The content of rosmarinic acid was 0.020%—0.344%. The content of isorosmarin was 0.0016%—0.0988%. Multi-component quantitative results showed that the contents of isorosmarin and rosmarinic acid increased significantly in the withering period of cluster. The results of the content determination were consistent with the fingerprint pattern recognition results, and they can be verified mutually.Fingerprint combined with chemical pattern recognition methods and multi-component quantitative analysis was used to monitor the overall chemical information ofduring the whole growth and development process from herbs to medicines. This method is comprehensive and easy to operate. It can be used as a reference for elucidating the “summer withering with good quality”, standardizing the collection ofand comprehensively evaluating its quality.

L.; UV fingerprint; HPLC fingerprint; principal component analysis; partial least squares method-discriminant analysis; isorosmarin; rosmarinic acid; multi-component quantification

R286.2

A

0253 - 2670(2021)07 - 2082 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.07.025

2020-08-09

長沙市科技計劃項目（kq2004063）；湖南中醫藥大學中藥學開放基金項目（2020ZYX11）

劉月新（1983—），女，碩士，實驗師，從事中藥藥效物質基礎研究。E-mail: 158769882@qq.com

夏伯候（1983—），男，副教授，從事中藥藥效物質基礎及其質量標準化研究。E-mail: 411816629@qq.com

[責任編輯 時圣明]