通痹方藥效部位提取工藝優化及抗炎鎮痛作用研究

趙 雨，王 倩，蘭亞榮，張立明，2，3*

(1.寧夏醫科大學 藥學院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏特色中醫藥現代化工程技術研究中心，寧夏 銀川750004；3.回醫藥現代化省部共建教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750004)

骨痹是五體痹中的一種，是因風寒濕邪久羈人體筋骨關節、閉阻經脈氣血所致的肢體痹證類疾病[1-2]，相當于現代醫學中的風濕性關節炎、腰椎間盤突出癥、強直性脊柱炎、肩周炎等骨傷科痹證。中醫認為“氣血痹阻不通，筋脈關節失于濡養”是骨痹的主要病機，然而西醫對其病因仍不十分明確。目前西醫仍缺乏針對該病病因有效的治療措施，且治療時間長、費用高昂、易復發。而中藥制劑有其獨特的優勢，表現出整體調節、多層次、多靶點的特點，在緩解癥狀、提高患者生活質量方面療效顯著，且副作用小，為多數患者接受。

通痹方是寧夏回族自治區中醫醫院臨床應用多年的中藥復方，專治骨傷科痹證，由沒藥、白胡椒、紅花、川烏、伸筋草、桑枝6味中藥組成[3]，其中川烏、伸筋草溫經散寒，白胡椒溫中止痛、散寒除濕，桑枝祛風濕、通經絡，沒藥散瘀定痛，紅花活血通經、散腫止痛，具有顯著的活血消腫、抗炎通絡、祛風散寒、除濕止痛等作用[4-5]。該通痹方已在寧夏中醫醫院臨床應用多年，效果良好，無毒副作用，需要進一步研究其藥效成分及藥理作用為新藥開發奠定基礎。因此本文主要就通痹方的提取工藝優化和抗炎鎮痛作用進行研究。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

雌性KM小鼠，體質量18～22g，購自寧夏醫科大學實驗動物中心。動物飼養于由寧夏醫科大學實驗動物中心無特定病原體(Specific pathogen free，SPF)級動物房。實驗環境：溫度：(22±2)℃，相對濕度：50%～60%，動物房保持通風、干燥，自由飲水，鼠料定量飼養。

1.2 藥材與藥品

紅花(安徽泰源中藥飲片有限公司，批號：141016)；沒藥(石家莊市柏林藥材加工廠，批號：070101)；白胡椒(石家莊市柏林藥材加工廠，批號：070101)；川烏(石家莊市柏林藥材加工廠，批號：170101)；桑枝(石家莊市柏林藥材加工廠，批號：070101)；伸筋草(石家莊市柏林藥材加工廠，批號：070101)；野木瓜片(廣東和平藥業有限公司，批號：Z44021242)；雙氯芬酸鈉緩釋片(諾華制藥，批號：H10980297)；復方對乙酰氨基酚片(西南藥業股份有限公司，批號：H20013003)。

1.3 實驗試劑

無水乙醇(天津市大茂化學試劑廠)；吐溫-80(100 mL，天津市大茂化學試劑廠)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(500 g，天津市大茂化學試劑廠)；生理鹽水(4.5 g，湖南科倫制藥有限公司)。

1.4 實驗儀器

XL-08B粉碎機(廣東市旭朗機械設備有限公司)；RE-2000A型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；DHG-9075A型電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；BWSsn電子計重稱(廈門佰倫斯電子科技有限公司)；XB 220A電子分析天平等。

2 實驗方法

2.1 工藝路線

根據通痹方中各味藥的特點，確定提取工藝為先進行揮發油部位提取，再進行醇溶性部位提取。

2.2 揮發油部位提取工藝優化[6-7]

2.2.1 供試品溶液制備 取粉碎后的藥材1份，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入沸石2～3粒，加入蒸餾水，浸泡一定時間后，置于電熱套上，連接揮發油提取器及球形冷凝管，開啟加熱，開啟冷凝水，溫度保持微沸，直至提取結束，揮發油不再增加(照中國藥典2015年版四部《通則2204揮發油測定法》甲法項下方法進行提取)，讀取揮發油提取器中油狀液體(揮發油部位)體積并收集于西林瓶中，得到揮發油部位。

2.2.2 揮發油提取正交試驗 選取浸泡時間(h)、加水倍數(倍)、提取時間(h)三個因素，每個因素設定3個水平，采用L9(33)設計正交試驗考察水蒸氣蒸餾法對揮發油提取的影響，以揮發油量為指標，正交試驗設計見表1。

表1 揮發油部位提取正交試驗因素水平

2.3 醇溶性部位提取工藝優化[8]

2.3.1 供試品溶液制備 將提取揮發油后的藥液過濾，藥渣置于圓底燒瓶中，加入乙醇，連續回流，濾過，用乙醇清洗藥渣和容器，濾液旋至稠浸膏狀，用乙醇轉移至蒸發皿中，自然揮干乙醇后，置于烘箱烘干，即得醇溶性部位。

2.3.2 醇提正交實驗 選取乙醇濃度(%)、乙醇用量(mL/g)、提取時間(h)三個影響因素，每個因素設計3個水平，用L9(33)正交表實驗優選乙醇回流提取工藝，以方中胡椒堿含量(色譜峰峰面積)為指標，正交試驗設計見表2。

表2 醇部位提取正交試驗因素水平

2.4 高效液相法(HPLC)測定醇溶性部位有效成分(胡椒堿)含量

2.4.1 色譜條件 C18柱；流動相：甲醇-水(77∶ 23)；檢測波長：343 nm；流速：1 mL/min；進樣10 μL；柱溫：25 ℃。

2.4.2 對照品溶液制備 精密稱取胡椒堿對照品0.005 g，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，作對照品溶液，備用。

2.4.3 供試品溶液制備 分別精密稱取各組醇部位浸膏約0.1 g，置于已編號(①～⑨)的10 mL容量瓶中，加甲醇溶解(必要時可超聲加速溶解)，并定容至刻度，做供試品溶液備用。0.45 μm微孔濾膜過濾，分別置于已標號(①～⑩)的進樣瓶中，照色譜條件自動進樣，記錄峰面積及保留時間(表7)。

2.4.4 方法學考察 (1)線性關系。精密吸取不同濃度的對照品溶液，分別進樣，記錄色譜圖，繪制工作曲線見圖1。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，線性回歸，得回歸方程。

(2)精密度。分別精密吸取③號醇部位供試品溶液，按上述色譜條件連續重復進樣6次，測定峰面積，結果見表9。

(3)穩定性。精密吸取③號醇部位供試品溶液，分別于放置0、3、6、9、12、24 h后進樣，記錄色譜圖，峰面積見表10。

(4)重復性。取③號醇部位供試品，按供試品溶液制備方法，平行制備6份溶液，依法進樣，峰面積見表11。

2.5 抗炎鎮痛作用研究[9-12]

2.5.1 熱板法致小鼠疼痛實驗 將60只SPF級小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為：①空白對照組(1 mL1%吐溫-80+生理鹽水)；②揮發油組(3 mL/kg，由1%吐溫-80+生理鹽水制成溶液)；③醇部位組(以通痹方生藥量計，下同)(3 g/kg，由0.5% CMC-Na制成混懸液)；④揮發油+醇部位組(1.5 mL/kg+1.5 g/kg，由0.5%CMC-Na制成混懸液)；⑤陽性對照組1(對乙酰氨基酚，0.3 g/kg，由0.5%CMC-Na制成混懸液)；⑥陽性對照組2(野木瓜片1.2 g/kg，由0.5%CMC-Na制成混懸液)。

將熱板箱放入裝滿水的恒溫水浴鍋中，使水溫控制在(55±0.5)℃ (用溫度計測量)。熱板箱預熱 10 min后，將70只雌性小鼠逐只放入熱板箱中，用秒表記錄小鼠自放入熱板箱后至出現舔后足的時間(s)作為每只小鼠的痛閾值。每日定時給各組小鼠進行灌胃給藥1次，根據小鼠體重確定給藥量，連續7 d，空白組除外，末次給藥后30 min、1 h各測1次痛閾，凡在熱板上60 s內無反應的小鼠立刻取出，痛閾值以60 s計(以免燙傷小鼠足趾)。

2.5.2 二甲苯致小鼠耳腫脹實驗 將60只SPF級小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為：①空白對照組(1%吐溫-80+生理鹽水)；②揮發油組(3 mL/kg，由1%吐溫-80+生理鹽水制成溶液)；③醇部位組(3 g/kg，由0.5%CMC-Na制成混懸液)；④揮發油+醇部位組(1.5 mL/kg+1.5 g/kg，由0.5%CMC-Na制成混懸液)；⑤對照1(雙氯芬酸鈉，0.04 g/kg，由0.5%CMC-Na制成混懸液)；⑥對照2(野木瓜片1.2 g/kg，由0.5% CMC-Na制成混懸液)，除空白組外，每日定時給各組小鼠進行灌胃給藥1次，根據小鼠體重確定給藥量，連續7 d，末次給藥30 min后，各組小鼠右耳廓前后均勻涂抹二甲苯0.02 mL/只致炎，左耳作對照。

半小時后脫頸椎處死，沿耳廓基線剪下雙耳，并采用直徑為7 mm的不銹鋼打孔器將小鼠雙耳同部位等面積切下，分析天平稱重，計算兩耳重量之差，小鼠左右兩側耳片重量差即為腫脹度，計算各組小鼠耳腫脹抑制率(%)。耳腫脹抑制率(%)=(空白組組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度) /空白組平均腫脹度×100%。

2.6 統計學處理

3 結果

3.1 揮發油部位提取工藝優化

表3 揮發油部位提取正交試驗結果

表4 結果分析

根據表1揮發油因素水平表進行實驗，讀取揮發油毫升數，最終得出結果見表3：在實驗條件下揮發油最優提取工藝為A3B1C3(加水10倍，浸泡1 h，提取10 h)。各因素對揮發油提取率的影響順序為C>B>A，即提取時間>加水倍數>浸泡時間。見表4。

3.2 醇部位提取工藝優化

表5 醇部位提取正交試驗結果

根據表2醇部位因素水平表實驗，通過高效液相色譜法確定醇部位指標性成分含量(見表5)，最終得出結果見表6、表7。在該實驗條件下，醇部位最優提取工藝為A3B1C3(乙醇濃度85%，乙醇用量6倍，提取時間3 h)。各考察因素對醇部位提取率的影響順序為A>B>C，即乙醇濃度>乙醇用量>提取時間。

3.3 HPLC測定醇溶性部位有效成分(胡椒堿)含量實驗結果

在優化實驗條件下對標準液進行稀釋，以胡椒堿標準品的濃度為橫坐標、色譜峰面積為縱坐標作圖，得線性回歸方程及相關系數，見圖1。結果表明，胡椒堿在0.000 5～0.012 5 mg/μL范圍內均具有良好的線性關系，相關系數為0.984 9。

在優化實驗條件下對樣品進行測定，精密度實驗中色譜峰保留時間RSD為0.14%，峰面積RSD為0.19%，表明該方法的精密度良好；穩定性實驗中色譜峰保留時間RSD為1.08%，峰面積RSD為0.24%，說明穩定性良好，樣品至少在24 h內穩定；重復性實驗中色譜峰保留時間RSD為1.31%，峰面積RSD為0.26%，說明該方法重復性良好。詳見表8、表9、表10。

表6 結果分析

表7 HPLC法測定醇部位指標性成分含量結果

圖1 線性關系考察

表8 精密度考察

表9 穩定性實驗考察

表10 重復性測定

3.4 抗炎鎮痛作用研究

3.4.1 熱板法致小鼠疼痛實驗結果 實驗結果顯示，與空白對照組相比，通痹方揮發油組、醇部位組、揮發油+醇部位組在給藥0 min、15 min和30 min后均對熱刺激小鼠所致疼痛反應潛伏期(痛閾值)升高，其中醇部位組、揮發油+醇部位的小鼠在給藥15、30 min后熱刺激所致疼痛反應潛伏期(痛閾值)較其他給藥組顯著升高(P<0.05)。實驗結果表明通痹方中揮發油、醇部位、揮發油+醇部位對熱板所致的小鼠疼痛均有抑制作用，但揮發油+醇部位抑制疼痛作用較其他部位更顯著，且在給藥30 min后抑制疼痛效果顯著(P<0.05)。結果見表11。

表11 通痹方對熱板致小鼠疼痛反應的影響

3.4.2 二甲苯致小鼠耳腫脹實驗結果 實驗結果顯示，與空白對照組相比，各給藥組在給藥30 min后對二甲苯引起的小鼠的耳腫脹均有抑制作用。其中，通痹方醇部位較其他給藥組對二甲苯引起的小鼠的耳腫脹有顯著抑制作用，差異具有統計學意義(P<0.05)，腫脹抑制率達到了33.4%。表明通痹方中各部位具有一定的抗炎作用，醇部位較其他部位抗炎作用強。結果見表12。

表12 通痹方對二甲苯致小鼠急性耳腫脹抑制率的影響

4 討論

在中醫理論中，痹證、頑痹、痛風等是由于正氣不足、氣血運行不暢而引起的表現為關節腫脹、疼痛、屈伸不利等癥狀的一類疾病。該病在臨床上以膝關節疼痛反復發作、關節變形及不同程度的功能障礙為特點[13-14]，可伴有體重減輕、低熱、疲乏感、晨僵、疼痛、畸形、類風濕結節等全身癥狀。

通痹方是由沒藥、白胡椒、紅花、川烏、伸筋草、桑枝組成的經驗方，方中藥物含有豐富的揮發油、生物堿與黃酮類成分。沒藥揮發油、白胡椒揮發油、紅花黃色素、桑皮苷、烏頭堿等能明顯抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹及大鼠蛋清所致的足趾腫脹，提高小鼠痛閾值。該方劑理論和臨床應用基礎良好。

本研究結果顯示，通痹方揮發油部位的最優提取工藝為：加水10倍，浸泡1 h，提取10 h。醇部位的最優提取工藝為：乙醇濃度85%，乙醇用量6倍，提取時間3 h。在抗炎鎮痛實驗中，與空白對照組相比，末次給藥0、15、30 min后，通痹方醇部位和揮發油+醇部位組的小鼠熱刺激所致疼痛反應潛伏期(痛閾值)顯著提高(P<0.05)，其鎮痛作用明顯。在抗炎實驗中，只有醇部位組，小鼠耳腫脹抑制率達到了33.4%，與空白組比較差異具有統計學意義(P<0.05)，而揮發油組、揮發油+醇部位組小鼠耳腫脹抑制率與空白組比較差異無統計學意義。

綜上所述，經過提取工藝優化過的通痹方具有明顯的抗熱刺激痛作用，并具有一定的抗炎效果，但其抗炎鎮痛的作用機制和相關通路還有待進一步研究。