通脈降濁解毒方對缺血性腦卒中大鼠皮質神經生長相關蛋白-43表達的影響研究

李九席，焦紅軍，任 明

(鄭州大學第二附屬醫院，河南 鄭州 450003)

缺血性腦卒中是指由局部腦組織血液循環障礙引起的腦組織供氧、供血障礙，導致的局部腦組織崩解壞死情況[1]。患者軸突往往不能有效再生，導致患者發病后常出現吞咽、語言、認知、運動等功能障礙[2]。積極有效的治療措施對改善患者受損腦組織功能、提高患者生活質量具有積極意義。臨床上通常通過藥物治療及康復訓練方式促進患者腦功能恢復，通過給予藥物治療或其他刺激加強內源性神經的修復，并抑制誘導突觸與神經元胞體死亡的不良因素，從而促進患者腦功能重塑[3]。研究指出，微環境對神經功能的修復會產生重要影響[4]。神經生長相關蛋白-43(GAP-43)是神經生長于神經元發育的標志蛋白，同時也是缺血性腦卒中病發后軸突生長的標志物，通過觀察GAP-43的表達情況，可以對缺血性腦卒中的神經修復過程進行有效判斷和評估[5]。本研究旨在探討通脈降濁解毒方對缺血性腦卒中病灶周圍GAP-43表達水平的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠48只，體質量(250±20)g。購自凱學生物科技(上海)有限公司，許可證號：NO.0251284。在18～26 ℃室溫、自然光線環境下用無菌蒸餾水與飼料飼養。

1.1.2 藥物 “通脈降濁解毒方”組方 陳皮、茯苓、丹參、白芍各20 g，黃芩、柴胡、枳實各15 g，半夏、大黃各10 g，甘草10 g。藥材均取自本院中藥房，加入8倍量水煎煮2次后過濾去除藥渣，制成相當于原生藥2 g/mL的水煎液。

1.1.3 儀器與試劑 本次實驗主要儀器及試劑信息見表1。

表1 主要儀器、試劑信息

1.2 缺血性腦卒中大鼠模型制備

將48只健康雄性SD大鼠分籠飼養1周，隨機將大鼠分為正常組、模型組、藥物低劑量組與高劑量組，每組各12只，每組又分為7 d與14 d亞組，各6只，之后采用熱凝閉大腦中動脈法制備大鼠模型。首先腹腔注射水合氯醛(0.5 mL/100 g，6%)對大鼠進行麻醉，將其右側在手術臺上固定，去除顳頂左側鼠毛，并用碘伏與乙醇對局部皮膚進行消毒清潔。于大鼠左耳、左眼間將皮膚切開，進行顳肌分離并使顳骨翼板充分暴露，注意避免對大鼠顳神經造成損傷。采用牙科鉆自顳骨翼板通至硬腦膜，在動物手術顯微鏡下找尋大鼠大腦動脈。用小咬骨鉗去除大鼠部分顱骨，使大腦中動脈近端充分暴露。采用電凝器對大腦動脈(近端與大腦下靜脈段)進行凝閉，正常組大鼠不用凝閉，之后對大鼠顳肌與皮膚進行縫合。待大鼠蘇醒后用Longa評分法對大鼠模型質量進行評估，1～3分表示模型制備成功[6]。Longa評分標準：大鼠無神經損傷表現，記為0分；大鼠手術對側前、后爪無法完全伸展，記為1分；大鼠行走時朝手術對側轉圈，記為2分；大鼠行走時朝手術對側傾倒，記為3分；大鼠無法自行行走，記為4分。大鼠Longa評分越高，說明神經功能損傷越嚴重。

1.3 治療方法

對正常組及模型組大鼠采用0.9%NaCl注射液灌胃，劑量5 mL/kg，1次/d。低劑量組與高劑量組按照60 kg體重成人用藥量10倍、20倍的“通脈降濁解毒方”灌等量藥物，1次/d。對各組大鼠實施連續治療至造模后的第7天、14天，分別進行平衡木行走實驗與轉棒上行走實驗，之后處死大鼠，觀察各組大鼠病灶周圍GAP-43表達水平。

1.4 實驗方法

1.4.1 運動功能檢測[7-8]在大鼠連續治療7 d、14 d后進行平衡木行走實驗與轉棒上行走實驗。平衡木行走實驗：選取一條長170 cm、寬2 cm的木棒放置在離桌面7 cm處，讓大鼠在平衡木上行走，10 min/d。評分標準：大鼠成功穿過平衡木且未跌倒，記為0分；大鼠可以穿過平衡木，且跌倒概率<50%，記為1分；大鼠可以穿過平衡木，但跌倒概率>50%，記為2分；大鼠可以穿過平衡木，但癱瘓側后肢不能輔助移動，記為3分；大鼠無法穿過平衡木，但可以坐在平衡木上，記為4分；大鼠無法穿過平衡木，坐在平衡木上會掉落，記為5分。每只大鼠平均進行4～10次測試，根據大鼠的總跌倒次數判斷大鼠的跌倒概率。轉棒上行走實驗：準備一根長150 cm、d=4.5 cm的木棒，將其一端固定于轉動器上，轉動器轉速設置為3r/min，進行左右交替式轉動，大鼠在轉棒上進行行走、旋轉、抓握等運動，10 min/d。評分標準：大鼠在木棒轉動過程中可以行走，記為0分；在木棒轉動過程中大鼠不會掉落，且能堅持1 min以上，記為1分；木棒開始轉動后大鼠會掉落，記為2分；木棒開始轉動前大鼠就掉落，記為3分。

1.4.2 GAP-43表達水平檢測 各組大鼠在治療7 d、14 d后進行GAP-43表達檢測，腹腔注射水合氯醛對大鼠進行麻醉(0.5 mL/100 g，6%)，將大鼠固定在手術臺上，心臟灌注4%多聚甲醛之后斷頭取腦。切取2 mm包含病灶的大鼠腦組織，用4%多聚甲醛進行固定，并在常規濃度梯度乙醇中進行脫水，在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡后用石蠟包埋，并進行連續切片，取厚5 μm的切片，通過鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法檢測病灶周圍GAP-43的表達情況。切片常規脫蠟、水化，并按照試劑盒上的操作說明嚴格執行各項操作過程。DAB顯色鏡檢，在400倍視野中選取5個不重疊的視野，采用尼康NIS-Elements D 3.0圖像獲取分析軟件測定陽性表達無的光密度積分。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠Longa評分比較

正常組大鼠由于未進行大腦動脈凝閉，神經功能并未受損，故評分用“-”代替。模型組、低劑量組、高劑量組大鼠在治療7 d后，Longa評分分別為(2.82±0.63)分、(2.20±0.23)分、(1.48±0.13)分；治療14 d后，Longa評分分別為(2.51±0.44)分、(1.44±0.20)分、(0.81±0.22)分。各組間的同期評分結果，差異具有統計學意義(P<0.05)。Longa評分越高，提示大腦的神經功能受損情況越嚴重，觀察結果可知，3組大鼠在治療后Longa評分均有所上升，模型組采用生理鹽水灌胃，故考慮可能是腦組織正常區域搭建側支循環通過代償作用改善病灶部位的缺血、缺氧情況，但大鼠自身代償能力有限，故Longa評分變化幅度較小。低劑量組與高劑量組治療14 d的Longa評分明顯高于同組治療7 d時的評分結果，提示通脈降濁解毒方可以有效改善缺血性腦卒中大鼠的神經功能，促進大鼠腦功能重塑。且大鼠神經功能的恢復情況與藥物濃度表現出一定的相關性，高劑量藥物能夠更有效地促進大鼠神經功能恢復。各組大鼠Longa評分比較見表2。

表2 各組大鼠Longa評分比較 分)

2.2 各組大鼠平衡木行走實驗與轉棒上行走實驗評分比較

治療7 d時，高劑量組大鼠平衡木行走實驗與轉棒上行走實驗評分均明顯低于模型組與低劑量組(P<0.05)，模型組與低劑量組比較均無明顯差異(P>0.05)；治療14 d時，低劑量組大鼠平衡木行走實驗與轉棒上行走實驗評分均明顯低于模型組(P<0.05)，高劑量組大鼠平衡木行走實驗與轉棒上行走實驗評分均明顯低于模型組與低劑量組(P<0.05)，差異具有統計學意義(P<0.05)。平衡木行走實驗與轉棒上行走實驗評分越高說明大鼠的肢體運動障礙越明顯，運動能力越差。觀察結果可知，3組大鼠在治療后運動功能均逐漸恢復，模型組大鼠運動功能恢復可能建立在自身出現側支代謝循環的基礎上，運動功能得到小幅度回升。低劑量組與高劑量組治療14 d的評分結果明顯高于同組治療7 d時的評分結果，說明通脈降濁解毒方可以有效促進大鼠神經功能恢復，從而提高大鼠的運動功能。且大鼠運動功能的恢復情況與藥物濃度表現出一定的相關性，高劑量藥物能夠更有效地促進大鼠運動功能恢復。各組大鼠平衡木行走實驗與轉棒上行走實驗評分比較見表3。

表3 各組大鼠平衡木行走實驗與轉棒上行走實驗評分比較 分)

2.3 各組大鼠GAP-43蛋白光密度積分比較

觀察結果可知，GAP-43陽性表達在圖像中呈顆粒狀，治療7 d時低劑量組與高劑量組的圖像結果較為密集，光密度積分較高，分別為(85.92±9.20)分與(96.83±10.67)分，高劑量組GAP-43蛋白平均光密度積分明顯高于低劑量組。正常組與模型組的圖像結果相對分散，光密度積分分別為(22.09±3.30)分與(67.46±7.24)分。治療14 d后，正常組大鼠光密度積分為(22.06±3.32)分，較治療14 d時無明顯變化。其他3組積分較治療7 d時均發生回落，模型組、低劑量組、高劑量組積分分別為(61.10±6.85)分、(75.56±8.51)分、(82.23±9.38)分，3組間的同期比較結果均存在顯著差異，差異具有統計學意義(P<0.05)。高劑量組各時間段的光密度平均積分均為最高，提示通脈降濁解毒方可以有效刺激機體病灶周圍GAP-43蛋白表達，且其表達水平與藥物濃度表現出一定的正相關性。詳見表4。

表4 各組大鼠GAP-43蛋白光密度積分比較 分)

圖1 各組大鼠7 d后GAP-43陽性表達(HE染色，×400)

圖2 各組大鼠14 d后GAP-43陽性表達(HE染色，×400)

3 結果

缺血性腦卒中是指大腦血管出現閉塞或狹窄導致局部腦組織血流灌注障礙，導致腦組織出現缺血、缺氧性損傷。大腦出現缺血性腦卒中后，谷氨酸會在細胞間隙堆積，局部病灶區域由于缺血、缺氧及炎癥反應會引發機體代謝功能紊亂，機體產生與清除自由基的代謝平衡被打破，導致患者出現神經功能損傷[9]。具體表現為患者腦細胞壞死、神經功能與腦組織受損、出現運動功能障礙并伴隨各種炎癥反應等[10]。通常出現缺血性腦卒中時，機體會通過構建側支代謝循環的方式改善缺血腦組織的腦神經功能。但機體自身的代償能力是有限的，往往難以有效改善疾病癥狀。不良的內環境(如炎性環境)及低下的神經元再生能力都是造成神經系統損傷后預后不良的主要原因[11]。當前臨床研究結果表明[12]，抑制性蛋白異常表達、促生長因子水平低下、營養因子缺乏、膠質瘢痕的產生均會對神經功能的修復造成不良影響。

GAP-43是神經組織的特異性磷酸蛋白，在發育或再生的軸突生長錐末端高表達[13]。其能夠促進神經細胞分化與軸突生長的作用，并能參與受損神經系統的修復與腦功能重塑過程，具有促進軸突再生、神經細胞生長與突觸重建的能力。GAP-43作為軸突生長的分子標志蛋白，在缺血性腦卒中病灶周圍通常會呈現出高表達狀態。通常情況下，在出現缺血性腦卒中后，GAP-43的表達水平就會立即上升，在7 d時到達峰值。隨著神經系統的發育成熟，其表達水平會逐漸回落[14]。中藥治療可以通過調節GAP-43的表達水平，改善病灶周圍微環境，從而有效促進受損腦組織的神經功能修復與腦功能重塑[15]。

中醫學將缺血性腦卒中歸于“中風”范疇，認為其病機在于痰瘀互結、阻于腦竅，痰濁、肝風、瘀血阻竅導致神不導氣、竅閉神匿，需治以清熱解毒、通脈降濁之方[16]。本次研究選用“通脈降濁解毒方”，其中陳皮理氣健脾、燥濕化痰，茯苓健脾寧心、利水滲濕，活血通經、祛瘀止痛，白芍養血調經、平肝止痛，黃芩清熱燥濕、瀉火解毒，柴胡和解表里、疏肝升陽，枳實破氣消積、化痰散瘀，半夏燥濕化痰、消痞散結，大黃逐瘀通經、涼血解毒，甘草調節諸藥，可祛痰通絡、標本兼治。

徐磊[17]研究發現，針灸與康復訓練可以顯著提高大鼠GAP-43的表達水平，說明通過康復治療可以有效促進大鼠受損神經元的軸突修復與突觸建立，從而有效提高大鼠神經可塑性，改善大鼠的運動功能與認知功能。陳露露等[18]研究指出活血醒腦開竅方可以通過抑制神經細胞的凋亡過程，增強神經因子表達水平，加強神經系統的調節功能來降低大鼠病灶周圍腦組織的炎性反應，提高GAP-43的表達水平，促進大鼠受損腦組織的神經功能修復。2項研究均為在藥物或康復治療作用下，大鼠GAP-43高表達從而改善疾病癥狀。本次研究結果表明，給予大鼠通脈降濁解毒方可以有效改善大鼠的神經功能，且其表現出一定的藥物依賴性，高劑量組大鼠的Longa評分與平衡木行走實驗、轉棒上行走實驗評分均明顯高于模型組與低劑量組，說明高劑量組大鼠的神經功能與運動功能恢復情況明顯優于同期其他組別(P<0.05)。觀察各組大鼠GAP-43表達水平可知，在治療7 d、14 d時，高劑量組大鼠GAP-43水平明顯高于同期其他組，除正常組外，其他組大鼠GAP-43水平在治療14 d時均發生一定的回落，與上文中講到的GAP-43在卒中發生后即會出現高表達，7 d時達到峰值，而后逐漸降低的結果一致，說明通脈降濁解毒方可以提高缺血性腦卒中大鼠GAP-43的表達水平，從而有效改善大鼠的受損神經功能，促進大鼠腦功能重塑。

本研究尚存在一些不足之處：研究并未闡明通脈降濁解毒方參與調節缺血性腦卒中的作用機制，僅能通過相關臨床研究推測通脈降濁解毒方可以降低病灶血管的通透性，從而減少受損腦組織的含水量，避免水腫使神經細胞受到繼發性損害。此外，藥物能夠有效延緩血管內血栓的形成時間，延緩疾病進一步進展，并提高大鼠抗缺氧能力。通脈降濁解毒方還能促進GAP-43的表達，改善病灶腦組織的微環境，促進受損神經的修復與腦功能重塑。至于通脈降濁解毒方的詳細作用機制仍需要學者們進行不斷深入探究。

綜上所述，通脈降濁解毒方可以促進大鼠受損神經功能修復，改善大鼠神經功能與運動功能，其可能與GAP-43表達水平的上升有關。