果蠅培養(yǎng)條件優(yōu)化和唾液腺染色體標本制備技術改進

（廣東省韓山師范學院食品工程與生物科技學院 廣東潮州 521041）

果蠅具備染色體基數(shù)少、世代周期短（10～15d）、子代個數(shù)眾多、可遺傳突變性狀多樣的特點，因此是科學研究領域服務時間較長、研究較為深入的模式生物之一。通過眾多科學研究者的試驗，最終發(fā)現(xiàn)存在于果蠅唾液腺的巨大染色體是觀察染色體畸變如缺失、重復、倒位的最佳材料。因此，果蠅唾液腺染色體的觀察也是遺傳學實驗中的一個經(jīng)典實驗。如何快速獲取品質優(yōu)良的果蠅唾液腺材料并且簡便制成清晰度高的染色裝片，是順利開展遺傳學實驗教學首要解決的問題。下面將在果蠅幼蟲的培養(yǎng)、唾液腺的剖離、唾液腺的解離、染色、壓片等方面進行改進和優(yōu)化。

1 果蠅幼蟲培養(yǎng)基的選擇

目前大多實驗室所飼養(yǎng)的果蠅為黑腹果蠅，而適用于三齡幼蟲培養(yǎng)的品系是野生型黑腹果蠅，它的適應力強，繁殖能力也強，而且在野外環(huán)境也能采集到。教材中常用玉米粉紅糖培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基營養(yǎng)較為豐富，但是配置步驟較多，而且需要添加適量防腐劑去抑制霉菌的生長。筆者發(fā)現(xiàn)釀制米酒的酒糟不僅營養(yǎng)豐富，飼養(yǎng)蟲體肥大，還能儲存較長時間，無需再添加其他防腐劑，這與酒糟中所含低度酒精有關。因此，直接選用糯米酒的酒糟作為培養(yǎng)果蠅三齡幼蟲的培養(yǎng)基。為了方便挑取和觀察幼蟲的形態(tài)大小，選擇直徑為15～20 cm大培養(yǎng)皿（大小皿蓋盡量貼合，防止成蟲逃逸）作為培養(yǎng)專用器具，使用前要消毒處理。添加酒糟的高度不超過小皿蓋的1/2，這么做可以保證果蠅成蟲的活動空間，也能為幼蟲提供充裕的養(yǎng)分。

2 果蠅幼蟲的培養(yǎng)溫度

由表1可知，果蠅的最適培養(yǎng)溫度為25℃，但是三齡幼蟲適宜溫度為17～18℃。為此，在接入果蠅成蟲1～3 d的培養(yǎng)溫度設為25℃，有利于快速產(chǎn)卵，第四天則改為18℃，有助于幼蟲減少活動，加快進食，營養(yǎng)物質體內快速積累。待到15～18 d，可以觀察到數(shù)量眾多的三齡幼蟲出現(xiàn)在皿壁上。

表1 培養(yǎng)溫度對果蠅生長周期的影響

3 果蠅唾液腺的剖離

此時，要選擇以附著在皿壁、活動緩慢、個體肥大的三齡幼蟲。提取的器具可用大頭針的鈍端、牙簽。由于三齡幼蟲表面會有食物殘渣或分泌物，可采用生理鹽水對其進行沖洗。沖洗完畢的幼蟲可轉到冰塊上快速麻醉處理，方便后續(xù)剖離操作。再將蟲體轉移到干凈載玻片上，雙手各持一只大頭針，用左手的大頭針將幼蟲尾部輕壓固定好，接著用右手的大頭針尖端準確點到黑色口器部位，徑直向前拉伸。學生暫時不能確切判斷唾液腺所在位置，因此需要把帶有蟲體載玻片放到體視鏡下觀察。唾液腺的鏡檢特征為一對上小下大的囊狀半透明結構，形似絲瓜，通常附有帶狀灰白色脂肪體，緊連著黑色口器。建議先把蟲體尾部直接去除，再小心挑去口器、腸道等器官。

4 果蠅唾液腺的低滲、解離

添加1或2滴蒸餾水，處理2～3 min，促使唾液腺的細胞破裂、染色體盡量分散。用吸水紙小心吸取多余的水，再滴加1或2滴物質的量濃度為1 mol/L的鹽酸，促使細胞解離，有利于染色液更好滲透。同樣用吸水紙吸取多余的酸液。

5 唾液腺的染色

將改良苯酚品紅染液滴入充分解離的材料，靜置染色10～15 min。完成染色后，不要急于壓片，而是將染色的材料放到高倍鏡下觀察唾液腺細胞內核膜未撐破，巨大染色體呈線團般緊密纏繞的形態(tài)，讓學生對巨大染色體有初步印象，避免與腸道殘留細胞核的“張冠李戴”。

6 壓片

用鑷子夾取潔凈無痕的蓋玻片，蓋玻片接觸材料的外圍染液并與載玻片的接觸點保持45°斜角，緩緩地下降，確保兩者接觸面不出現(xiàn)氣泡。把兩張稍大于載玻片的吸水紙覆蓋在蓋玻片上，左手的拇指和食指分別輕輕地固定吸水紙與蓋玻片重疊的對角，右手拇指朝著蓋玻片的中央位置用力壓平。切勿來回搓動，否則染色體的結構會嚴重變形。

7 鏡檢結果

判斷制作良好裝片的標準為：細胞膜及核膜已破，染色體分散良好，橫紋分帶清晰度高，背景較干凈。教師可以選取染色體臂分散良好的玻片，指導學生觀察染色中心、蓬突、橫紋、間紋，引導學生思考為何果蠅染色體數(shù)是2n=8，唾液腺細胞染色體卻呈現(xiàn)放射狀5長1短的6條臂。

8 結果與討論

從實驗結果可知，制片的改進之處在于：①培養(yǎng)基原料改為釀制米酒的酒糟。果蠅以酵母菌為食，酒糟能夠提供大量酵母菌，而且酒糟中還富含糖類、蛋白類營養(yǎng)物質，非常有助于幼蟲生長和儲存營養(yǎng)，同時酒糟作為釀酒副產(chǎn)品是不難獲得的。②幼蟲的輕度麻醉，冷凍法能夠避免有機溶劑如乙醚的環(huán)境污染問題，且簡單易行。③對唾液腺細胞低滲和酸解的處理，是促使細胞膜、核膜破裂的有效方法之一。④壓片的手法技巧必須明確的是染色體臂分散開來的力量為快速準確地擠壓。