RACK1在苯環(huán)利定致精神分裂癥模型小鼠腦中的分布特點#

鐘妍 王勁松 魯英鵬 蔣禮蓉 黃薪嶼 萬莉紅

（1.四川大學華西基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院2016級法醫(yī)學，四川 成都 610041；2.四川大學華西基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院藥理學教研室，四川 成都 610041）

精神分裂癥是臨床常見的嚴重的精神疾病，以定向力障礙、推理及問題解決、思維處理速度異常、學習與記憶能力下降等多種認知功能障礙為主要表現(xiàn)[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，以小膠質(zhì)細胞為代表的免疫細胞功能異常與精神分裂癥發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。

臨床研究表明，精神分裂癥患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)中小膠質(zhì)細胞明顯活化，不僅具有分泌促炎細胞因子的作用，還可激活下游的谷氨酸或者氧化應激途徑[3]。尤其在精神分裂癥急性期，小膠質(zhì)細胞M1極化所釋放的促炎因子IL-6、TNF-α明顯升高[4]；而具有抑制炎癥作用的M2極化所釋放的IL-10則分泌不足[5]。可見，探尋小膠質(zhì)細胞活化的調(diào)控因素將有利于深入研究精神分裂癥的發(fā)病機制。

活化的C激酶1受體（Receptor of activated C-kinase 1，RACK1）是位于核糖體的支架蛋白，也是NF-κB信號通路中重要的負調(diào)控因子[6]，對TNF-α等因子的轉(zhuǎn)錄具有一定的調(diào)節(jié)作用[7]。然而RACK1是否參與精神分裂癥的疾病過程尚無報道。本文擬通過建立小鼠精神分裂癥模型，觀察RACK1在腦內(nèi)的分布特點，初步評價RACK1與精神分裂癥的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

苯環(huán)利定購自上海凱試科技有限公司，50 mg/瓶，批號P295500；試驗前用生理鹽水配制成0.375 mg?ml-1苯環(huán)利定溶液。C57BL/6清潔級雄性小鼠，體重16-18 g，購自成都達碩動物有限公司，飼養(yǎng)于室溫22-24℃、相對濕度50-60%、12 h晝夜循環(huán)交替照明環(huán)境中，所有小鼠自由攝食飲水并保持籠舍清潔。適應性飼養(yǎng)1 w后進行試驗。

1.2 方法

1.2.1 精神分裂癥模型建立

將48只雄性C57BL/6小鼠隨機分為對照組和精神分裂癥模型組（n=24），其中模型組小鼠皮下注射苯環(huán)利定（Phencyclidine，PCP）1.5 mg?kg-1連續(xù)7 d建立精神分裂癥模型；對照組小鼠連續(xù)7 d皮下注射等體積生理鹽水。

1.2.2 刻板行為實驗

將小鼠分別置于40 cm×40 cm×30 cm的觀察箱中，適應3 min后觀察小鼠1 min內(nèi)的行為狀態(tài)。小鼠處于靜止、睡眠狀態(tài)記1分；小鼠處于靜止，清醒狀態(tài)記2分；正常的梳理和咀嚼行為記3分；在箱內(nèi)活動、嗅、站立（正常的警覺行為）記4分；在箱內(nèi)跑動（活動亢進）記5分；正常活動水平下在箱內(nèi)重復的探索行為（較緩慢的方式）記6分；活動亢進的情況下在箱內(nèi)重復的探索行為（較快速的方式）記7分；在同一個位置重復快速地擺頭和/或前肢運動(活動受限制)記8分；出現(xiàn)跳躍、維持異常的姿勢和運動障礙記9分。測定5次后取平均值作為該小鼠的刻板行為最后得分。

1.2.3 病理分析及免疫熒光染色

每組隨機選取小鼠5只，處死后以4%多聚甲醛心臟灌注固定，取腦組織制作全腦石蠟切片進行HE染色以及免疫熒光染色。免疫熒光染色切片以抗IBA-1和RACK1一抗（1: 200）4℃過夜孵育，次日復溫至室溫后以PBS洗3次，5 min?次-1；加入Cy3標記的熒光二抗（1:1000），室溫孵育2 h后清洗、封片，熒光顯微鏡下拍照觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計學軟件Prism 5.0進行統(tǒng)計處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±SD）表示，采用t檢驗；P<0.05被認為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 刻板行為評估

精神分裂癥模型組在觀察箱中出現(xiàn)明顯的在箱內(nèi)重復的探索行為、在同一個位置重復快速地擺頭和/或前肢運動、跳躍等刻板行為。經(jīng)5次重復測定后均分統(tǒng)計顯示，與對照組相比，PCP模型小鼠的刻板行為評分明顯高于對照組（P< 0.05），見圖1。

圖1 小鼠刻板行為評分（n=24）

2.2 腦組織病理學分析

HE染色結(jié)果顯示，對照組小鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整、胞體清晰、排列整齊。精神分裂癥模型組小鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與對照組小鼠相比未見明顯改變，但排列不規(guī)則；且小膠質(zhì)細胞明顯增生。

2.3 小鼠腦內(nèi)RACK1免疫熒光表達情況

RACK1在小鼠海馬組織、中腦杏仁核、前額葉皮層均有分布，但對照組小鼠RACK1表達量較低，呈現(xiàn)的綠色熒光較淺；而精神分裂癥模型組小鼠海馬組織綠色熒光強度（RACK1）明顯增強，紅色熒光強度（IBA-1）略為增強，但并未出現(xiàn)IBA-1與RACK1融合，見圖2。

圖2 小鼠海馬RACK1免疫熒光表達（×400，n=24）

3 討論

PCP屬于精神活性物質(zhì)，具有誘導動物認知和感覺異常、模擬精神分裂癥多重行為的作用，是目前建立精神分裂癥動物模型的首選藥物[8]。本次研究發(fā)現(xiàn)PCP注射后，誘發(fā)小鼠出現(xiàn)快速擺頭、跳躍等刻板行為，這些刻板行為正好反映精神分裂癥的陽性癥狀。可見，0.375 mg·ml-1苯環(huán)利定連續(xù)皮下注射7 d可成功建立小鼠精神分裂癥模型。

研究顯示精神分裂癥與腦膠質(zhì)細胞功能水平關(guān)系密切，包括：少突膠質(zhì)細胞丟失[9]，小膠質(zhì)細胞活化[4-5]以及星形膠質(zhì)細胞過度激活[10]。可見，精神分裂癥是中樞多種類型細胞參與的復雜的嚴重腦部疾病。其中活化的小膠質(zhì)細胞因具有高度異質(zhì)性和可塑性，成為當今研究的一大熱點。而RACK1作為中樞廣泛存在的核糖體蛋白，目前研究發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控細胞生長、調(diào)控免疫功能等多種作用。為探究精神分裂癥小鼠腦內(nèi)RACK1的分布情況，本次研究采用免疫熒光染色的方式，通過標記小膠質(zhì)細胞標記物IBA-1與RACK1雙染觀察二者的共定位情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)精神分裂癥小鼠海馬區(qū)RACK1表達明顯增強，但是與IBA-1并未見共定位，從目前表達RACK1的細胞形態(tài)觀察來看，仍以神經(jīng)元表達為主；而且神經(jīng)元的排列明顯出現(xiàn)不整齊的現(xiàn)象，說明RACK1與精神分裂癥小膠質(zhì)細胞活化的相關(guān)性不大；而主要與神經(jīng)元功能水平相關(guān)。

因此RACK1的表達分布特點可能與精神分裂癥的行為、認知功能障礙相關(guān)，深入研究揭示神經(jīng)元RACK1在精神分裂癥中的作用將會為精神分裂癥的疾病診治開創(chuàng)新的視野。