孕期糖皮質激素暴露所致子代長骨發育異常研究進展

王佳琪，倪曲波，肖 浩，汪 暉，陳廖斌

(1.武漢大學中南醫院骨科, 2.發育源性疾病湖北省重點實驗室, 3.武漢大學基礎醫學院藥理學系，湖北 武漢 430071)

糖皮質激素(glucocorticoid，GC)是腎上腺皮質產生的主要激素，在妊娠過程中對胎兒各臟器的分化發育有一定促進作用。人工合成GC用于治療有早產風險的孕婦已有近40年歷史，其能通過促進肺表面活性物質的合成，增強肺表面張力，實現促胎肺成熟，有效減少早產兒呼吸窘迫綜合征發生和死亡率，但可使胎兒內源性GC水平降低。同時，臨床回顧性研究及動物實驗發現，母親在妊娠期間暴露于尼古丁、乙醇、咖啡因[1]等外源物可導致母體血GC水平異常升高，其可通過胎盤進入胎兒體內，導致胎兒血GC高于正常生理濃度。近年來研究表明，孕期使用人工合成類GC或暴露于不良環境后所致胎兒血GC水平異常，可引起胎兒神經內分泌代謝編程改變，導致胎兒低出生體重及多種臟器發育障礙。已有研究表明，胎源性骨質疏松癥與孕期異常GC暴露有關[2]。因此，胎兒血GC是影響胎兒包括骨在內的多器官分化發育的重要因素?；诖?，該綜述著眼于當下孕期GC暴露現狀，對孕期內外源性GC暴露所致胎兒長骨發育異?，F象進行總結，并概述其表觀遺傳學和內分泌代謝編程機制。

1 孕期糖皮質激素暴露現狀及分類

由于工業化導致環境中各種污染物水平增加，女性孕期與各種不良環境的接觸機會增多。作為孕期一類常用藥物，人工合成GC(如地塞米松等)在臨床中的應用也較為廣泛。

1.1 孕期不良環境所致母源性糖皮質激素過暴露孕期不良環境是指包括外源環境因素(如：外源物暴露、微生物感染等)和母體健康因素(如：營養不良、妊娠合并疾病等)在內的多種負面因素。宮內發育遲緩(intrauterine growth retardation，IUGR)是指各種原因導致的胚胎或胎兒生長發育限制，表現為多器官功能發育障礙、生長遲緩及低出生體重。不良環境是除先天因素以外造成胎兒IUGR的重要因素。已知，宮內GC對胎兒各臟器的分化發育有一定促進作用，但過高水平GC則會導致胎兒發育障礙(如:IUGR等)，其潛在機制可能與母體高水平血GC通過胎盤到達胎兒血中，抑制胎兒下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary- adrenal，HPA)軸，進而影響諸多器官發育有關。有動物研究表明，大鼠妊娠d 9～20接受尼古丁(2.0 mg·kg-1·d-1)皮下注射,產后早期(出生后d 1、d 7)后代體內皮質酮水平明顯升高[3]，而產后晚期(出生后d 35、d 60、d 100)則降低，原因是孕期尼古丁暴露導致胎兒母源性GC過暴露，限制了胎兒HPA軸的發育。同樣，在孕期通過灌胃法給予乙醇4 g·kg-1·d-1的大鼠，檢測到孕d 20胎兒的血清皮質酮水平明顯升高[4]。此外，孕期多種不良環境暴露如外源物、微生物感染、營養、抑郁[5]等，均可導致母源性GC水平升高，使得胎兒血GC也升高，阻礙胎兒宮內發育。以上研究提示，孕期母體外源物暴露會導致胎兒母源性GC過暴露。

1.2 孕期合成類糖皮質激素應用孕婦在孕期可能使用到的有指征的外源性糖皮質激素主要包括：潑尼松、地塞米松、倍他米松、丙酸倍氯米松和氫化可的松。其具體適應癥及建議用量詳見Tab 1。值得注意的是，使用這些糖皮質激素治療孕期并發癥的同時，會對胎兒產生不良影響。已有文獻報道，孕期使用大劑量(≥20 mg·d-1)潑尼松有可能導致死胎；孕期使用地塞米松有可能導致胎兒宮內發育遲緩，且會導致子代成年后多種代謝性疾病易感；孕期使用倍他米松有可能導致胎兒宮內發育遲緩及成年后代謝綜合征易感；孕期大劑量(≥1 000 μg/次)使用吸入性糖皮質激素倍氯米松有可能導致胎兒先天畸形(主要是肌肉骨骼、心臟發育畸形)等。根據美國婦產科醫師協會實踐標準，妊娠24～34周合并早產風險的婦女應接受單療程地塞米松或倍他米松肌肉注射，接受該治療后d 7～14仍在懷孕的婦女，建議在短期效應的基礎上進行多次人工合成GC治療，以此來降低早產風險和胎兒死亡率。隨著產前地塞米松治療在臨床上的廣泛應用，人們更加需要考慮潛在的后續不良反應。有報道稱，產前地塞米松暴露(prenatal dexamethasone exposure，PDE)與胎兒低出生體重和體型縮小有關，在妊娠d 9-20的大鼠皮下注射0.2 mg·kg-1·d-1地塞米松，在孕d 20檢測到雌性胎兒血地塞米松濃度為267 nmol·L-1，為母體血清地塞米松濃度的31.6%[6]，即母體內地塞米松可進入胎兒循環，并導致胎兒體重下降，IUGR率升高。這提示，將胎兒過度暴露于人工合成GC，增加了后代發育異常的風險。

Tab 1 Indications and dosage of possible glucocorticoid use during pregnancy

2 孕期糖皮質激素暴露對子代長骨發育的近、遠期影響

骨的發生起始于胚胎時期，來源于間充質，主要有兩種方式，即膜內成骨和軟骨內成骨。人體大多數骨，如四肢骨、軀干骨等，都以軟骨內成骨方式發生。人胚胎從第四周末即開始進行軟骨內成骨過程。胎兒長骨發育受血GC調控，正常的成骨過程建立在合適的血GC水平之上，過早的暴露于高GC(包括內源性和外源性)環境將阻礙長骨發育過程。

孕期內外源性GC暴露對骨發育具有近期影響和遠期編程效應。其不僅可以在宮內阻礙胎兒長骨發育進程，還可引起子代成年后一系列長骨發育相關的健康問題和疾病易感。

2.1 出生前后長骨發育異常生長板(growth plate)是骨骺與骨干之間在次級骨化中心出現后保留的一層軟骨細胞，是胎兒出生后長骨縱向生長的基礎。在母豬妊娠最后45 d，每2 d肌肉注射地塞米松會導致其雄性后代股骨、脛骨生長板增生、肥大區厚度明顯變薄[7]。多項流行病學調查表明，孕婦攝入咖啡因與胎兒體長增長受損有關。有動物研究提示，從孕d 11-20給予大鼠咖啡因(120 mg·kg-1·d-1)灌胃，母嬰血GC水平均升高，胎兒體長明顯減少，胎兒股骨生長板中細胞外基質成分合成明顯抑制，生長板中軟骨生成延遲[8]。在另一項動物研究中，用地塞米松誘導骨發育受損模型，構建的大鼠模型也表現出骨生長板狹窄、生長板軟骨細胞增殖減少、凋亡增加的現象[9]。在小鼠(懷孕平均持續36～38 d)妊娠d 20開始皮下注射125 mg·kg-1·d-1地塞米松，直至產前，其后代生長板肥大區厚度明顯變薄，生長板軟骨細胞蛋白聚糖含量明顯降低[10]，地塞米松暴露會上調脛骨生長板中糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor，GR)的表達，抑制骨的縱向生長。以上研究結果表明，孕期GC暴露會明顯抑制長骨生長板的發育。

骨化中心包括初級骨化中心和次級骨化中心，是軟骨內成骨過程中長骨中央和兩端軟骨內首先骨化的區域。孕期給予地塞米松的大鼠，H&E染色顯示股骨初級骨化中心明顯縮短，礦化區域變小，骨小梁長度變短，進一步研究發現，產前咖啡因暴露導致的宮內高GC環境也導致胎兒股骨長度明顯縮短，初級骨化中心長度也縮短[11]。另外，孕期外源性地塞米松多次、高濃度、早期暴露對長骨和軟骨發育有更強的毒性[12]，表現為子代股骨初級骨化中心長度顯著縮短。這些結果都表明，孕期高GC會顯著影響長骨初級骨化中心的發育。

2.2 成年后骨質疏松癥易感及可遺傳性峰值骨量是人或動物一生中骨礦物質組織的最高含量，它可以反映骨骼的健康狀況。在人類中，青春期骨質積聚的峰值率在11～14歲之間(6～12周齡的幼鼠)，成年后最高峰在20～35歲之間(7～9月大鼠)。出生前24 d給予地塞米松的仔豬出生時即表現為長骨骨密度、骨礦含量降低[13]。一項對雞胚的研究證明，產前地塞米松暴露可致發育中的雞胚長骨縮短，并加速鈣鹽的沉積，降低骨量[14]。本實驗室動物研究表明，產前地塞米松暴露可顯著降低雄性子代峰值骨量，其骨量的降低從孕20 d一直持續到生后28周，并可以延續到孫代(雄性)，其機制與地塞米松介導的血管緊張素轉換酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)組蛋白乙?；鰪娪嘘P。

孕期不良環境暴露和直接使用人工合成GC都會導致母嬰血GC水平升高，引起胎兒發育遲緩和低出生體重，最終導致成年后骨質疏松癥易感。對大量臨床隨訪總結發現，在懷孕期間暴露于地塞米松會影響胚胎的成骨作用，主要原因可能是地塞米松在發育過程中對骨祖細胞產生不利影響。部分較早的臨床研究表明，孕期因治療早產所使用地塞米松治療會影響產后胎兒的骨礦化[15]。

最新研究提示，孕期咖啡因暴露所致的母源性高GC，可以通過激活后代骨局部腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin-system，RAS)、抑制胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1，IGF1)的表達，抑制后代長骨發育，導致子代成年后骨質疏松癥易感。孕期尼古丁暴露可以通過升高母體皮質酮，影響成骨細胞、破骨細胞的分化進程，延遲后代初級骨化中心的形成。后續研究表明，孕d 9～20適量地塞米松暴露會延緩胎鼠長骨發育、降低后代峰值骨量、增加成年鼠骨質疏松癥易感性[16]，并且胎鼠峰值骨量的降低具有代際遺傳效應。以上研究結果都提示，孕期內源性高GC以及一定劑量的地塞米松暴露，可以導致后代成年后骨質疏松癥的易感性顯著升高，且這一改變具有代際遺傳的特點。

3 孕期糖皮質激素暴露所致長骨發育異常的發生機制

宮內長骨的發育異常機制，主要與宮內異常GC暴露下骨發育過程中相關細胞的發育異常、骨發育相關基因表觀遺傳學修飾和內分泌代謝編程改變有關。孕期不良環境所致的母體內分泌代謝紊亂是后代多種代謝性疾病易感的一個主要因素。HPA軸是機體重要的神經內分泌軸，孕期不良環境(如：外源物暴露、合成類糖皮質激素直接應用)一方面可以破壞胎盤中滅活GC的11β-羥類固醇脫氫酶2(11β-HSD2)，破壞胎盤對母體來源GC的屏障功能；另一方面可直接或間接使母親HPA軸活性增加，使其效應器官——腎上腺分泌功能旺盛。兩者合力使得胎兒血GC水平異常，導致胎兒包括骨在內的多器官發育障礙。

參與骨發育的細胞主要包括軟骨細胞、成骨細胞、破骨細胞和血管內皮細胞。軟骨內骨化過程中軟骨細胞的肥大、凋亡與后續成骨細胞分化關系密切。肥大前及肥大早期由軟骨細胞分泌的印度刺猬(Indian hedgehog ，IHH)蛋白控制著成骨細胞分化的開始。成骨細胞和生長板軟骨細胞可以表達腎上腺素B2(Ephrin B2)等多種蛋白，促進成骨細胞分化并抑制破骨細胞形成，同時破骨細胞以打隧道的方式溶解吸收退化的軟骨組織。由肥大的軟骨細胞高度表達和分泌的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)能直接刺激骨血管內皮細胞趨化、增殖和分裂，從而刺激骨血管生成。綜上所述，在軟骨內骨化過程中各細胞分化發育息息相關。

3.1 軟骨細胞相關機制早在1997年就有研究指出，產前用人工合成GC(曲安奈德)處理的母鼠，其子代肱骨生長板軟骨細胞排列更加紊亂[17]。長骨生長板軟骨細胞分泌的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)在宮內骨骼生長中起著重要作用。IGF1相關信號通路是機體內調控內分泌系統的主要通路之一，其參與包括骨在內的多種組織和器官的分化發育，IGF1/IRS途徑通過調節軟骨細胞早期發育過程中PI3K/Akt磷酸化來調節ECM蛋白的合成。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)信號也參與各種骨細胞的存活、粘附、增殖、遷移和分化。內源性高GC首先通過降低胎兒生長板軟骨細胞中IGF1啟動子區域的H3K9和H3K27乙?；剑瑢е翴GF1蛋白表達水平降低，且IGF1R、IRS1和AKT1/2的蛋白表達水平也呈降低趨勢，整體上降低軟骨細胞ECM合成[18]；其次，內源性高GC上調絲裂原誘導基因6(mitogen-inducible gene，Mig-6)的表達，由此抑制軟骨細胞中EGFR / c-Jun N末端激酶(JNK)信號通路和末端分化基因的表達并減少軟骨細胞凋亡，延緩軟骨內成骨進程[19]，兩者合力最終導致胎兒長骨發育遲緩。以上研究提示，內源性高水平GC在降低軟骨細胞外基質合成的同時延緩軟骨細胞終末分化和凋亡，阻礙軟骨內成骨的進程。

3.2 成骨細胞相關機制成骨細胞是貼附于軟骨基質表面形成新生骨組織的主力軍。RAS具有調節局部細胞分化的作用，包括細胞增殖、分化和凋亡。另外，在軟骨ECM合成調節中發揮主要作用的IGF1，在間充質干細胞的定向分化中也起到至關重要的作用。外源性GC(地塞米松)一方面增強骨局部ACE啟動子區H3K9和H3K27乙?；剑⒃黾友芫o張素II(angiotensin II，Ang II)表達水平，表現為骨局部RAS激活，從而降低骨髓間充質干細胞的成骨分化。此外，該表觀遺傳學改變原理還與孕期接觸外源物種類有關。如導致內源性GC水平升高的乙醇(ethanol)會介導早期生長反應因子1的高表達并促進其進入骨髓間充質干細胞核，介導ACE啟動子區乙?；缴遊20]；導致內源性GC水平升高的尼古丁(nicotine)通過作用于α4β2-煙堿乙酰膽堿受體(α4β2-nAChR)，誘導組蛋白乙?；竝300進入骨髓間充質干細胞核，導致ACE啟動子區H3K9乙?；皆黾拥萚21]。另一方面內源性高GC通過誘導糖皮質激素受體(GR)進入骨髓間充質干細胞核內，募集增強子結合蛋白α，分別降低成骨細胞中IGF1的 H3K9和H3K14組蛋白乙酰化水平，導致長骨局部IGF1表達降低，使得長骨內諸如Runx2、Osterix、Ⅰ型膠原等多種成骨分化相關標志物表達降低[22]，最終導致成骨分化障礙，此表觀遺傳學改變可以延遲到出生后。本實驗室由此提出胎源性疾病宮內編程的GC-胰島素樣生長因子1(GC-insulin-like growth factor 1，GC-IGF1)軸理論：即宮內高濃度的GC通過表觀遺傳學機制抑制IGF1的表達，骨發育受到影響；胎兒出生后脫離宮內高GC環境，IGF1表達有所恢復，但個體對環境刺激的敏感性增加，更易受到環境對個體造成的損傷作用。GC對胎兒產生的表觀遺傳學影響大多是通過促進局部組織細胞內GR核轉位實現的。

3.3 破骨細胞相關機制在骨發育過程中，隨著血管、成骨細胞、破骨細胞及其祖細胞侵入肥大軟骨細胞區，破骨細胞降解礦化的肥大軟骨細胞，為骨細胞的沉積提供空間。因此從長骨發生的角度來講，破骨細胞數量的增加會加速礦化軟骨基質的降解，從而增強軟骨內骨化。核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)及其受體RNAK和其誘餌受體骨保護素(osteoprotegerin，OPG)是調節破骨細胞形成的關鍵分子，參與骨發育和骨代謝。孕期內源性高GC暴露的胎兒經TRAP染色顯示，股骨軟骨-骨交界處破骨細胞數量明顯減少。雖然RANKL的mRNA表達沒有明顯受到GC的影響，但骨局部OPG mRNA表達明顯上調，使得骨局部RNAKL/OPG比值顯著降低，因此軟骨-骨交界處破骨細胞數量也降低，延遲了軟骨內成骨進程[23]。但在體外，外源性GC(如地塞米松)可以刺激破骨細胞的增殖和分化，抑制成熟破骨細胞的骨吸收活性[24]，體現GC作用的雙相性，原因可能和個體發育階段有關。

3.4 血管內皮細胞相關機制VEGF-A是血管內皮細胞特異性的結合生長因子，可在體內誘導血管內皮細胞增殖、增加血管通透性。外源性GC(如地塞米松)暴露可使軟骨細胞VEGF-A表達增強，促進雛雞胚胎中趾骨內的血管生成、增殖和遷移。內源性高GC還會降低胎盤VEGF120和VEGF188亞型的表達，并在短期內阻止正常胎盤迷宮血管的發育[25]。由于GC可以通過胎盤進入胎兒體內，由此我們可以推測，內、外源性GC可能通過誘導骨局部VEGF相關亞型表達降低，從而抑制骨局部血管生成，抑制骨發育。

4 總結展望

綜上所述，孕期內、外源性GC暴露會對子代長骨發育產生深遠的影響，其發生機制見Fig 1。由于臨床產科地塞米松應用的劑量、時間、療程不盡相同，因此不同孕期、不同濃度、不同療程應用地塞米松對胎兒骨發育、出生后骨量增長、骨代謝性疾病易感性影響尚不明確。人們使用地塞米松等對早產、反復流產等進行預防與治療的同時，有必要篩選合理的劑量、時間范圍。另外，宮內GC對后代骨發育影響的代際遺傳效應已經被證明，但這種代際遺傳效應最終能持續多少代仍有待進一步研究。

Fig 1 Long bone dysplasia mechanism caused by glucocorticoid exposure during pregnancy