PD 小鼠模型應用硫辛酸對自噬蛋白表達水平的影響

魏濤 范小娟2

（1 徐州醫科大學公共實驗研究中心 221000 2 江蘇省軍區徐州第三離職干部休養所門診部 221000）

帕金森（PD）為中老年人常見的神經系統變性疾病，可累及神經、精神、運動系統損傷，誘發腦部病變，嚴重危害患者身體健康[1]。目前，臨床上尚未明確PD 發病機理，但可能與線粒體功能異常、自噬作用、細胞凋亡、氧化應激等有關[2]。國內外諸多研究證實[3-4]，線粒體自噬在保持神經元活性、神經細胞功能完整性方面具有重要作用。為進一步了解硫辛酸對PD 小鼠自噬蛋白表達水平的影響，現對80 只健康7 周齡雄性小鼠展開研討，具體如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

儀器與材料：LSM710 型激光共聚焦顯微鏡（德國蔡司公司），58404R 型高速臺式離心機（德國艾本德公司)。

免疫組化檢測試驗盒、BCA 蛋白測定試劑盒、PINK1 抗體、DJ-1 單克隆抗體、Parkin 單克隆抗體、MPTP 分別來自于上海莼試生物技術有限公司、北京市艾德萊生物科技有限公司、巴傲得生物科技有限公司、上海康朗生物科技有限公司、艾美捷科技有限公司、四川宇康生物技術有限公司、珠海市泛海生物技術有限公司、上海仁捷生物科技有限公司。

實驗動物：80 只健康7 周齡雄性小鼠（徐州醫科大學動物中心）。

1.2 方法

（1）分組方法：以抓鬮法把80 只小鼠均分成四組，即PD模型組、預保護組、研究組、正常對照組。

（2）模型制作：以MPTP 背部皮下注射方式，制備PD 小鼠模型。用背部皮下注射給藥方式予以研究組、預保護組、PD模型組MPTP25mg/kg，每周2 次，連續治療5 周。造模前，用以上同樣給藥方式給予預保護組a-硫辛酸60mg/kg；造模后，予以研究組a-硫辛酸60mg/kg，持續注射2 周。正常組不給予任何處理。

（3）行為學評分：在MPTP 用藥后，查看小鼠活動狀況。藥物注射3min 內，小鼠便出現全身抽搐、鼠尾與毛豎起、易激怒、抓鼻、步態蹣跚等反應，10～20min 后恢復至正常，即可判定模型制作成功。

（4）懸掛實驗：用金屬絲把小鼠掛到實驗臺上，高度控制為30cm，統計從懸掛到落地時間，并進行評分，其中，0～4s 即為0 分，5～9 分即為1 分，10～14s 即為2 分，15～19s 即為3 分，20～24s 即為4 分，25～29s 即為5 分，≥30s 即為6 分。

（5）爬桿實驗：自制爬桿，將小鼠頭向上放于頂部，統計小鼠從一開始運動到徹底轉變為頭朝下運動時間與抵達桿底的時間和。測試前，先訓練小鼠爬桿約5 次，再次測量5次，取其平均值，每次測試間隔時間控制為1min。

（6）以Western blotting 法測定DJ-1、Parkin、PINK1、TH：在行為學判斷后開展檢測。利用0.1mg/g10%水合氯醛實施腹腔注射，以完成深度麻醉；行斷頭操作，然后，于冰上實施開顱取腦，徹底洗凈殘余血液，把黑質紋狀體分離，并剪碎組織，將其與組織分解液充分混合，4℃下，離心，取上清液放于-80℃下保存備用。蛋白定量后，分裝，保證蛋白濃度相同；待添加等體積上樣緩沖液后，沸煮5min。之后，添加一抗，在4℃條件下孵育1 夜；洗膜后，將二抗加入，孵育（37℃）2h，再次洗膜。利用ECL 進行顯色，將顯影曝光，以Iamage lab 軟件對各蛋白表達情況進行分析。

以免疫組化法測定小鼠DJ-1、Parkin、紋狀體PINK1、黑質TH：待開展行為學評定后，采用10%水合氯醛實施麻醉，將心臟暴露，將靜脈留針穿入左心室，打開右心房，將生理鹽水注入左心房，用多聚甲醛進行灌注，斷頭取腦后，固定。梯度脫水，石蠟包埋，實施連續切片。選取小鼠紋狀體、黑質不重疊的4 倍視野4 個，在顯微鏡作用下觀測組織微觀結構變化狀況，統計陽性細胞數。陽性判定標準：細胞核表現為紫藍色或淺藍色，細胞漿表現為棕黃色。

1.3 統計學分析

用統計學軟件SPSS24.0 處理數據，計量資料（ ）以F檢驗，P＜0.05，即差異顯著。

2結果

2.1 4 組小鼠懸掛時間與爬桿時間對比

PD 模型組、預保護組、研究組懸掛時間均短于正常對照組，爬桿時間均長于正常對照組（P＜0.05）。PD 模型組懸掛時間均短于預保護組、研究組，爬桿時間均長于以上兩組（P＜0.05），見表1。

表1 4 組小組懸掛時間、爬桿時間對比（，s）

表1 4 組小組懸掛時間、爬桿時間對比（，s）

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2.2 4 組Western blotting 法檢測結果對比

較正常對照組，其他三組DJ-1、Parkin、PINK1、TH 水平下降（P＜0.05）。PD 模型組DJ-1、Parkin、PINK1、TH 水平均低于預保護組、研究組（P＜0.05），見表2。

2.3 4 組免疫組化法檢測結果對比

相比于正常對照組，其他三組DJ-1、Parkin、PINK1 陽性神經元數較少（P＜0.05）。PD 模型組DJ-1、Parkin、PINK1 陽性神經元數均少于預保護組、研究組（P＜0.05），見表3。

3 討論

近年來，跟隨著神經元變性的深入研究，發現PD 治療藥物組間失去效價與有效性，故而，臨床上需改變治療方案。限制藥物應用的重要原因為運動障礙等不良反應。硫辛酸屬生物膜成分，在動植物體內均可見。二硫代脂肪酸為硫辛酸還原形式，其可預防及避免氧化應激。二硫代脂肪酸與硫辛酸屬于天然抗氧化劑，為脫氧酶輔助因子，均可整合腦中金屬離子，增加維生素C、E 含量，減輕腦組織損傷，減少膜電位損傷量，提高相關酶活性，故而，就線粒體營養物而言，硫辛酸能起到靶向作用。在PD 常規藥物治療中，硫辛酸能有效減輕因抗PD 所引起的不良作用，進而提升患者運動功能與生活質量。鑒于此，可將硫辛酸作為PD 的新型方式。

表2 4 組Western blotting 法檢測結果對比（）

表2 4 組Western blotting 法檢測結果對比（）

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PINK1 常見于Parkin 上游，在機體線粒體功能受到損傷時，其能促使Parkin 蛋白活化，誘導吞噬反應。而Parkin 水平的下降，可造成線粒體斷裂，降低細胞對鈣離子的處理能力，增加對應激易感性。除氧化作用之外，DJ-1 也可誘發自噬反應。DJ-1 主要通過對Nurrl 的激活、上調多巴胺，改善TH 基因表達情況。DJ-1 缺失為造成自噬標志物堆積與線粒體表型的主要原因。所以，DJ-1 蛋白功能障礙能導致神經元損傷，從而誘發PD。研究中，四組懸掛時間、爬桿時間相比，存在明顯差異，其中，正常對照組懸掛時間最長，爬桿時間最短，PD 模型組懸掛時間最短，爬桿時間最長，這提示PD 模型制備成功，能有效保證后期實驗開展的有效性。四組DJ-1、Parkin、PINK1、TH 水平相比，正常對照組均最高，PD模型組均最低，這表示硫辛酸能改善PD 小鼠DJ-1、Parkin、PINK1、TH 表達水平。四組DJ-1、Parkin、PINK1 神經元數相比，正常對照組均最高，PD 模型組均最少，這說明硫辛酸能對PD 小鼠神經元具有一定保護作用。

表3 4 組免疫組化法檢測結果對比（，個/4 倍視野4 個）

表3 4 組免疫組化法檢測結果對比（，個/4 倍視野4 個）

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綜上，硫辛酸對PD 小鼠自噬蛋白表達水平可起到一定調節作用，有助于其病情控制。