淺淡水產品中硝基呋喃類代謝物檢測能力驗證體會

○楊惠宇 潘發林

能力驗證是通過各實驗室之間的比對，來對一個實驗室的能力進行考核。能力驗證是檢驗實驗室檢測水平的有效手段，也是保證實驗室質量管理體系得到有效改進的措施之一，有利于實驗室自我完善，它不僅體現檢測人員的技術水平，更是實驗室檢驗能力的一種體現。為了提高實驗室檢測能力，在做好實驗室內部質量控制的同時，我實驗室自2016年通過硝基呋喃類代謝物檢測認證后每年都積極參加農業農村局組織的能力驗證。單位需要在樣品簽收后96 h之內完成檢測工作并上報結果，報告需附稱樣記錄、標準溶液配制記錄、譜圖以及標準曲線等，回收率在70%-120%之間判定結果為滿意。

1 準備工作

1.1 實驗人員

檢測人員在檢測前要做好個人防護，按照檢測方法要求準備相應的檢測試劑、器皿、儀器設備等，并按照標準方法配制試劑、標注溶液等。檢測人員要充分了解實驗原理、熟悉實驗步驟、能夠正確處理實驗中每個環節，將操作誤差降到最低，使整個檢測過程的質量有所保障。

1.2 環境條件要求

在實驗之前將實驗室溫度調節到適宜溫度，實驗前處理室以及儀器室的溫度應控制在22-25℃。

1.3 準備器皿

準備實驗中將要用到的器皿，配制溶液時要使用經過檢定計量合格的移液器或器皿，所有器皿在使用之前需要驗證是否漏液，新的器皿用純水清洗，用過的器皿用甲醇清洗，確保沒有殘留；必要的時候用甲醇等試劑超聲清洗。

1.4 標準溶液的配置

檢查標準物質證書，確認標準物質是否在有效期內，根據標準物質的純度以及分子量進行換算。將8種標準物質按照標準的要求進行配置，分別配置成濃度為100μg/mL的同位素內標溶液，以及濃度為1.0 mg/mL的標準儲備溶液待用，4℃條件下保存期為180天。難溶的物質可通過超聲幫助溶解。將同位素內標溶液和標準儲備液分別用純水逐級稀釋成濃度為10 ng/mL和100 ng/mL的工作溶液。稀釋時徐將儲備液放置至室溫，觀察是否有晶體析出，如果有晶體析出需要重新搖勻至溶解后再進行稀釋。

1.5 所需藥品及配制

鹽酸溶液：0.2 mol/L；

二硝基苯甲醛（2-NBA衍生化試劑）：0.05 mol/L；

乙酸銨溶液：0.002 mol/L；

二甲基亞砜（國產）、磷酸氫二鉀（國產）、甲酸、乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、乙酸乙酯（色譜純）等。

1.6 儀器條件優化

儀器設備的準確性是影響實驗結果的關鍵性因素之一，對實驗中所需的儀器設備進行核查，確認儀器檢定校準是否在有效期內，是否能夠滿足實驗要求，可通過新配置的標準溶液進行驗證，確保準確無誤。若新配置的標準溶液靈敏度不夠高，需要優化儀器和檢測條件，可更換色譜柱、清洗離子源等，且控制液質室溫度為22-25℃。可提前將儀器優化到最佳狀態待用。

1.7 質控樣品制備與練習

按照檢測方法提前準備質控樣品，將陰性控制樣品（空白樣品）中加入已知濃度的標準物質冷凍過夜，可作為回收率試驗、平行試驗練習樣品。按照作業指導書要求將質控樣品作為待測樣品進行前處理練習，并上機檢測，進一步熟練檢測步驟。

2 樣品處理

2.1 核驗樣品

檢查樣品編號是否正確，確認樣品是否有效，如考核樣品呈完全解凍狀態或者運輸時間超過72 h則為無效樣品，需安排重新領取樣品。有效樣品需要立即開展實驗，不可放置過夜。樣品操作過程中盡量避光。

2.2 標準曲線的建立

本實驗選擇六個濃度點，分別為0.25、0.5、1、2.5、5、10 ng/mL，由于硝基呋喃類代謝物的標準曲線需要進行衍生化處理，因此標注曲線與待測樣品同時進行前處理。

2.3 樣品衍生化

待樣品自然解凍后，按照能力驗證文件要求，稱取3個平行待測樣品和空白樣品，檢測過程試劑空白和樣品空白需同步進行。質控樣品可選擇空白樣品加標，添加濃度一般為2-5倍定量限，也可選擇購買已知濃度的質控樣品，同時確保質控樣品和待測樣品在相同條件下進行前處理，保證操作步驟的一致性，將誤差降到最低。分別稱取2.00 g空白樣品于50 mL離心管中備用。首先加入50 μL同位素混合內標工作液，渦旋混合器混合50 s，再加入5 mL鹽酸溶液，300 μL二硝基苯甲醛溶液，渦旋混合器混合50 s，然后置于超聲清洗儀中超聲2 h，水溫控制在35℃左右，以上操作過程盡量避光操作。超聲結束后將樣品置于搖床中，溫度設置為37℃，恒溫震蕩17h。

2.4 樣品前處理

取出樣品，冷卻至室溫，首先加入磷酸氫二鉀溶液調pH值到7.4（±0.2），再加入4 mL乙酸乙酯，渦旋混勻60 s，4 000 r/min離心5 min，重復提取一次，合并上清液直接過Prime HLB固相萃取小柱，收集濾液至10 mL離心管中，38℃水浴氮氣吹干。準確加入1 mL甲醇（20%）-水溶液，渦旋混勻60 s，如果樣品油脂過多，可用低溫高速離心機13 000 r/min離心10 min，取下層溶液過0.22 μm濾膜，準備上機檢測。

2.5 上機檢測

本方法采用ACQUITY UPLC?BEH C 18柱；柱溫：35℃；流動相：A為2 mol/L乙酸銨水溶液，B為甲醇溶液；流速為0.3 mL/min；進樣量為10 μL。

ESI正離子化模式；儀器型號：Waters Xevo TQS；離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應檢測（MRM）；錐孔電壓：40 V；毛細管電壓：0.9 kV；脫溶劑氣溫度：50℃。

3 結果分析

首先檢查譜圖，看是否有積分不準確的情況，在積分準確的情況下通過對質控樣品回收率的分析，判斷此次實驗的質量控制情況，通過對質控樣品的分析，判斷此次能力驗證的結果偏高還是偏低。其次比較試劑空白和樣品空白譜圖，判斷是否在操作過程中有雜質引入以及基質干擾。最后仔細分析待測樣品的數據以及譜圖，判斷三個平行樣品之間重復性是否良好，計算質控RSD以及品行待測樣品RSD并上報結果。根據能力驗證文件要求及時在網站上報數據，并郵寄原始記錄等，原始記錄要求手寫并簽字。檢測結果見下表。

2020年水產品中硝基呋喃類代謝物能力驗證情況(ND表示未檢出)

4 能力驗證體會

隨著水產養殖業的發展，養殖面積的擴大，水產品的質量安全問題日益凸顯，食品安全問題成為老百姓越來越關注的問題。作為檢測機構，提高檢測能力、熟練掌握檢測方法、保證檢測質量是關鍵。只有提高檢測機構的檢測能力，才能更有效的保障水產品的質量安全。而能力驗證結果是實驗室管理水平和檢測人員檢驗能力的綜合體現，積極參加能力驗證對實驗室技術水平、檢驗人員的操作水平都有一定程度的提高。通過對能力驗證結果的分析，可發現自身與其他實驗室之間的差距與不足，以及實驗室在技術管理上的缺陷，從而保證實驗室與其他檢測結構檢測能力持平。能力驗證結果為滿意，在一定程度上增強了檢測人員的信心，進一步提高了本實驗室出具數據的可信度。對于水產品硝基呋喃類代謝物能力驗證掌握前處理方法和上機操作是關鍵，要加強檢測人員的技術水平，從實驗前期開始準備，把能力驗證作為實驗室的基本要求，只有檢測水平提高了，監管水平才會提高，水產品的質量安全才會得到保障，我們的檢測才是有意義的。

（通聯：130033，吉林省長春市水產品質量安全檢測中心）