Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼雙功能納米棒的制備及性質

吳燕利 徐賢柱 肖 強＊,

(1江西科技師范大學有機功能分子研究所，南昌 330013)

(2江西師范大學生命學院，南昌 330022)

0 引 言

近年來，納米藥物載體受到了科學家們的廣泛關注，這主要是由于它們能有效地提高小分子藥物在人體內的循環時間、減小其毒副作用，提高療效[1-3]。介孔SiO2是一種具有規則孔結構的無機納米材料，由于其比表面積較大、孔徑可調且分布均一、孔體積較大、表面易于修飾、穩定性高、生物相容性好等特性，在藥物釋放領域獲得了廣泛的應用[4-7]。目前，納米藥物載體的研發主要集中在納米粒子表面修飾靶向性分子，以保證其精準識別腫瘤細胞[8-9]和開發新型多功能納米材料[10-12]，將化療藥物分子、熱療試劑、光動力治療試劑以及成像造影劑整合在同一材料上。

稀土離子擁有豐富的能級結構和獨特的4f躍遷特性，稀土摻雜納米發光材料[13-17]由于發光效率高、穩定性好、對生物體的毒性低、熒光壽命長，是目前普遍看好的生物標記材料之一。稀土氧化物具有良好的化學穩定性和熱穩定性，是非常好的發光基質。以稀土離子Eu3+、Tb3+、Yb3+/Er3+等為激活離子和以氧化稀土為基質的納米材料的研究十分活躍。近年來，陸續有研究者將這種傳統發光材料用于生物標記[18-25]。以介孔SiO2和稀土氧化物為結構單元的多功能核殼結構納米粒子將介孔SiO2與稀土氧化物納米粒子融合在同一材料中，擁有稀土氧化物熒光納米粒子的優良光學性能和介孔SiO2的高孔容率以及生物相容性好的特質，并有效降低了稀土氧化物本身可能產生的細胞毒性，在藥物輸送和熒光成像方面展現出獨特的優勢[26-32]。Yang等[30]將Gd2O3∶Yb/Tm納米粒子包裹在空心SiO2的表面制備SiO2@Gd2O3∶Yb/Tm空心膠囊，該空心膠囊既可以用于藥物緩釋又可以用于熒光成像。Song等[31]制備了介孔SiO2包裹的Gd2O3納米粒子并將其成功用于腫瘤細胞的標記和鹽酸阿霉素的負載和緩釋。Dai等[32]將長余輝 ZnGa2O4∶Cr3+，Bi3+包裹在 Gd2O3@mSiO2核殼納米粒子的表面制備出長余輝Gd2O3@mSiO2@ZnGa2O4∶Cr3+，Bi3+納米復合材料，并將其應用于藥物緩釋和監測。

綜上所述，將介孔SiO2與稀土氧化物熒光納米粒子2種功能基元有效結合，可以充分發揮2種材料的優勢，在藥物輸送、跟蹤以及腫瘤細胞熒光標記等方面有潛在應用價值。目前，這方面的研究主要集中在球形核殼粒子的制備，對于棒狀Gd2O3與介孔SiO2復合材料的研究，目前還未見報道。然而，有研究表明[33-34]，相對于球形粒子，棒狀結構的納米粒子在細胞吞噬實驗中，能更快、更大程度地進入細胞內部。我們采用水熱法制備Gd(OH)3∶Eu納米棒，利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)作為模板，通過正硅酸乙酯(TEOS)水解將介孔SiO2包裹在納米棒的表面，煅燒后得到以Gd2O3∶Eu納米棒為內核，以介孔SiO2為外殼的多功能核殼納米棒。

1 實驗部分

1.1 儀器和藥品

所用藥品有稀土氯化物(由99.99%的氧化稀土經分析純鹽酸溶解，蒸去多余的酸后用蒸餾水配制)、濃氨水(25%)、TEOS(AR)、CTAB(AR)。實驗用水為去離子水。

采用FEI公司Quanta200F場發射掃描電鏡(SEM,15 kV)和TecnaiG20場發射高分辨透射電鏡(TEM，200 kV)觀察產物的形貌；利用BRUKER D8 Focous X射線衍射儀表征產物的晶體結構，Cu Kα輻射，λ=0.154 06 nm，電壓40 kV，電流30.0 mA，掃描范圍2θ=10°～80°；通過Perkin-Elmer C99957紅外光譜儀用溴化鉀壓片對樣品進行成分分析，測試范圍500～4 000 cm-1；采用Microtrac NPA152粒度分析儀測量樣品的粒徑分布；采用BELSORP-mini Ⅱ型比表面積及微孔孔隙儀分析樣品的孔性能，并通過Brunauer-Emmett-Teller(BET)方法計算表面積；采用Hitachi F4600熒光光譜儀測試樣品的激發和發射光譜；采用NM120-Analyst磁共振成像測試儀對樣品進行磁共振成像表征；采用Olympus FV1000共聚焦顯微鏡觀察細胞的熒光成像；采用ELX-800型酶標儀測定MTT(四甲基偶氮唑藍)吸光值。

1.2 Gd2O3∶Eu@mSiO2多功能核殼納米棒的制備

核殼復合物的制備流程圖如圖1所示。

圖1 Gd2O3∶Eu@mSiO2合成流程圖Fig.1 Fabrication process of Gd2O3∶Eu@mSiO2

1.2.1 Gd(OH)3∶Eu納米棒的制備

采用水熱法制備Gd(OH)3∶Eu納米棒。在燒杯中加入 GdCl3(0.05 mol·L-1，38 mL)和 EuCl3(0.05 mol·L-1，2 mL)，邊攪拌邊加入氨水至 pH=9，將得到的混合物攪拌均勻，轉移至水熱反應釜中，然后置于180℃烘箱中保溫10 h，自然冷卻至室溫，最后得到白色渾濁溶液。離心分離得到白色沉淀物Gd(OH)3∶Eu，用乙醇和水反復洗滌沉淀，產品放入80℃烘箱中烘干。

1.2.2 Gd(OH)3∶Eu@SiO2-CTAB的制備

在250 mL圓底燒瓶中加入100 mg的Gd(OH)3∶Eu納米棒，80 mL乙醇、10 mL水和100 mg CTAB，超聲分散10 min后，邊攪拌邊逐滴加入200μL TEOS和0.5 mL濃氨水，繼續攪拌12 h。將混合物離心分離，得到白色沉淀物。用無水乙醇和去離子水反復洗滌、沉淀3次后置于80℃烘箱中干燥。

1.2.3 Gd2O3∶Eu@mSiO2的制備

將干燥的Gd(OH)3∶Eu@SiO2-CTAB樣品轉移到坩堝中，在馬弗爐中800℃下煅燒3 h，冷卻后得到Gd2O3∶Eu@mSiO2樣品。

1.3 細胞熒光成像

在無菌條件下，將NCI-H460肺癌細胞接種于共聚焦專用的培養皿中，待細胞貼壁后棄去培養液，用PBS緩沖液(pH=7.4)洗滌細胞3次，再加入培養基稀釋的Gd2O3∶Eu@mSiO2溶液(100 μg·mL-1，100μL)，繼續孵育4 h，用PBS緩沖液洗掉未結合的Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒，于共聚焦顯微鏡下觀察細胞的熒光圖像。

1.4 細胞活力測試

用NCI-H460肺癌細胞測定樣品的細胞毒性。NCI-H460以5×104mL-1的細胞濃度接種于96孔板上，每孔100μL，在體積分數5%的CO2、37℃中孵育24 h，待細胞貼壁后，棄去原有培養基，向孔中加入200 μL不同濃度(0、25、50、100、200 μg·mL-1)的Gd2O3∶Eu@mSiO2培養基分散液，每個濃度樣本設平行的8個副孔。再將96孔板放入培養箱中孵育24 h，然后向每孔中加入現配的MTT溶液(5 mg·mL-1，20μL)，培養4 h，待MTT還原為藍紫色結晶甲臜，移去上清液，然后向每個孔中加入200μL DMSO(二甲基亞砜)，使藍紫色甲臜完全溶解，搖勻后使用酶標儀測定溶液在490 nm的吸光度(A)值，細胞的存活率按如下公式計算：Cell viability=(Asample/Acontrol)×100%，其中Asample為各孔在490 nm的吸光度，Acontrol為空白對照組在490 nm的吸光度。

1.5 布洛芬的吸附和釋放實驗

100 mg Gd2O3∶Eu3+@mSiO2樣品加入到布洛芬(IBU)的正己烷溶液(10 mL，50 mg·mL-1)中，將此混合液在密封條件下30℃攪拌24 h，之后離心分離裝載了IBU的樣品，用正己烷清洗3次，洗去樣品表面吸附的IBU(只保留樣品孔道中的IBU)，之后在60℃干燥12 h，裝載了IBU的樣品命名為IBU-Gd2O3∶Eu3+@mSiO2，采用熱重(TG)分析來確定IBU的負載量。

將IBU-Gd2O3∶Eu3+@mSiO2樣品轉移至錐形瓶中，浸泡于10 mL PBS緩沖溶液中(pH=7.4)，37℃緩慢振蕩，每隔一定的時間離心一次，用移液槍移取1 mL上層清液，立即用等量的新鮮PBS代替。用紫外可見分光光度計測定上清液在221 nm處的吸光度，計算IBU的釋放量。

2 結果與討論

2.1 SEM及TEM的表征

采用SEM和TEM對粒子的形貌進行觀察，如圖2和圖3所示。Gd(OH)3∶Eu由尺寸均勻、分散性良好的納米棒組成，納米棒的長度～400 nm，直徑～100 nm(圖 2)。

圖2 Gd(OH)3∶Eu的SEM圖Fig.2 SEM images of Gd(OH)3∶Eu

圖3 Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒的TEM圖Fig.3 TEM images of Gd2O3∶Eu@mSiO2

由圖3可知，制備的Gd2O3∶Eu@mSiO2為典型的核殼結構，核層Gd2O3∶Eu繼承了其前驅體Gd(OH)3∶Eu的棒狀形貌，尺寸也基本保持一致，殼層的厚度大約是30 nm，介孔均勻地分布在殼層表面。

2.2 XRD分析

分別對前驅物和經過800℃煅燒后的產物進行XRD分析，如圖4所示。由圖4a可見，前驅體樣品XRD圖和Gd(OH)3的標準圖(PDF No.38-1042)完全一致，而且沒有雜質峰，說明所得到的樣品為六方相的Gd(OH)3∶Eu。經過800℃煅燒后得到的樣品XRD圖和Gd2O3標準卡片(PDF No.12-0797)基本一致，未觀察到SiO2的峰(圖4b)，說明介孔硅為無定形結構，煅燒后所得樣品為Gd2O3∶Eu@mSiO2。

圖4 (a)Gd(OH)3∶Eu和(b)Gd2O3∶Eu@mSiO2的XRD圖Fig.4 XRD patterns of(a)Gd(OH)3∶Eu and(b)Gd2O3∶Eu@mSiO2

2.3 FTIR分析

為了進一步證實IBU分子已成功負載到Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒中，對樣品進行了詳細的FTIR光譜研究(圖5)，包括對純IBU分子(曲線a)和IBU負載產物(曲線b)的譜圖分析。在曲線a中，1 720、2 965(2 884)、1 516(1 450)和1 421 cm-1處的吸收帶歸屬于IBU分子的—COOH、C—Hx鍵、四元碳原子和—OH的彎曲振動，可以確定為IBU的結構。在曲線b中，除了在1 720～1 421 cm-1處的幾個吸收峰(圖中星號處)可以歸屬于IBU分子外，1 080和796 cm-1處的強吸收峰分別歸屬于Si—O—Si的不對稱拉伸和對稱拉伸彎曲，965 cm-1處的峰值對應于Si—OH對稱拉伸彎曲，這些峰值表明IBU分子已成功負載在Gd2O3∶Eu@mSiO2中。

圖5 (a)IBU和(b)IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2的FTIR譜圖Fig.5 FTIR spectra of(a)IBU and(b)IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2

2.4 BET比表面積

Gd2O3∶Eu@mSiO2的N2吸附-脫附等溫線如圖6所示，為典型的Ⅵ型吸附-解吸等溫線，表明Gd2O3∶Eu@mSiO2擁有介孔結構，孔徑主要分布在1.74 nm左右，這與TEM中觀察到的結果是一致的。通過BET方法計算得到其表面積為192 m2·g-1。

圖6 Gd2O3∶Eu@mSiO2樣品的N2吸附-脫附等溫線及孔徑分布圖(插圖)Fig.6 N2adsorption-desorption isotherm and pore size distribution(inset)of Gd2O3∶Eu@mSiO2

2.5 熒光性質

圖7為Gd2O3∶Eu@mSiO2在室溫下測得的激發(左)和發射(右)光譜，以613 nm為監測波長，測得的激發光譜中的最強激發峰位于254 nm，然后以254 nm為激發光波長測得其發射光譜，其591 nm處的發射峰對應于5D0→7F1躍遷，613和627 nm處2個強峰都對應Eu3+的5D0→7F2的磁偶極躍遷，654 nm處發射峰對應5D0→7F3躍遷發射的紅光。其中613 nm處的發射峰最強，顯示出以橙紅色為主的發光特征。

圖7 Gd2O3∶Eu@mSiO2樣品的激發(左)和發射(右)光譜Fig.7 Excitation(left)and emission(right)spectra of Gd2O3∶Eu@mSiO2

對IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2的發光強度與IBU釋放量的相關性進行研究發現，其發光強度與釋放量有很強的相關性。如圖8所示，對比負載前后的發射光譜曲線可知，負載的IBU嚴重淬滅了Eu3+的發光，藥物中具有高頻聲子振動的有機基團對藥物的發光有明顯的抑制作用。圖9為Eu3+的發光強度與IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2樣品中IBU的釋放量之間的關系曲線，隨著IBU的不斷釋放，樣品發光強度逐漸增大。IBU的釋放會減弱淬滅效應，進而增強藥物載體體系的發光強度[35-36]。這一趨勢表明，該功能材料在釋放過程中可通過光致發光強度跟蹤或監測。

圖8 (a)IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2 和(b)Gd2O3∶Eu@mSiO2的發射光譜Fig.8 Emission spectra of(a)IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2and(b)Gd2O3∶Eu@SiO2

圖9 IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2樣品的發光強度與IBU釋放量的關系Fig.9 Emission intensity of Eu3+in IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2 as a function of the cumulatively released IBU

為了研究Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒對細胞的熒光標記效果，我們將核殼納米棒與NCI-H460肺癌細胞共孵。圖10為質量濃度為100μg·mL-1的Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒的培養基分散液作用NCI-H460肺癌細胞4 h后，在405 nm激發下的熒光顯微照片。結合明場和暗場中的成像，可以看出紅色熒光是由Gd2O3Eu@mSiO2核殼納米棒發出的，這表明Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒能穿透細胞膜，成功標記NCI-H460肺癌細胞。

圖10 Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒與肺癌細胞共孵后的共聚焦熒光顯微照片Fig.10 Confocal fluorescence photomicrographs of NCI-H460 cell incubated with Gd2O3∶Eu@mSiO2core-shell nanorods

2.6 藥物負載和緩釋

選擇IBU作為模型藥物研究Gd2O3∶Eu@mSiO2體系的藥物負載和緩釋行為，首先通過TG分析來確定樣品對IBU的負載量，如圖11所示，負載前和負載后的失重相差10.25%，可知IBU的負載量為10.25%。

圖11 (a)Gd2O3∶Eu@mSiO2 和(b)IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2的TG曲線Fig.11 TG curves of(a)Gd2O3∶Eu@mSiO2and(b)IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2

圖12為IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2在pH=7.4的PBS緩沖溶液中的累積藥物釋放行為，由圖可知，該系統中的IBU在剛開始時被較迅速地釋放，這可能是核殼納米棒表面吸附的IBU被快速釋放，在12 h內釋放達到了54.8%，接下來更緩慢的釋放行為可能是由于介孔SiO2孔道中的IBU被緩慢地釋放。結果表明，該Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒具有明顯的緩釋功能。

圖12 IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2在PBS緩沖體系中的釋放曲線Fig.12 Cumulative IBU release profile of IBU-Gd2O3∶Eu@mSiO2in PBS buffer solution

2.7 Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒的生物相容性

材料的生物相容性對于其在生物醫學領域的應用非常重要。采用MTT法研究Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒對NCI-H460肺癌細胞的毒性，其結果如圖 13 所示。在 0～200 μg·mL-1范圍內，將 Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒與肺癌細胞共孵育24 h，發現核殼納米棒對吸光度值的影響很小，在所有劑量下，NCI-H460細胞都保持較高的活性(>90%)。結果表明，合成的Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒具有良好的生物相容性。本研究中提出的核殼雙功能納米棒是未來生物醫學工程中潛在的多功能生物材料。

圖13 不同濃度Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼納米棒作用于NCI-H460肺癌細胞24 h后的細胞相對活力圖Fig.13 In vitro cells relative viabilities of NCI-H460 lung cancer cells after incubating with different concentrations of Gd2O3∶Eu@mSiO2 core-shell nanorods for 24 h

3 結 論

綜上所述，我們通過簡單的水熱法和正硅酸乙酯水解法制備了一種新穎的Gd2O3∶Eu@mSiO2核殼雙功能(熒光和介孔)納米棒。結果表明，Gd2O3∶Eu@mSiO2具有明確的棒狀核殼結構和優異的發光性能。以IBU作為模型藥物研究其藥物釋放行為，結果證明可以根據Gd2O3∶Eu@mSiO2藥物傳輸體系的發光強度的變化來跟蹤和監測藥物的釋放過程。載藥量和釋放度研究表明，該體系具有良好的吸附和持續釋放性能。因此，合成的Gd2O3∶Eu@mSiO2在熒光成像、藥物緩釋和藥物追蹤等領域具有潛在的應用價值。