基于MAPKs 信號通路探討膝關節骨關節炎的研究進展

魏美娟,李 琴,羅林釗

（1.青海大學，青海 西寧 810000；2.青海省中醫院，青海 西寧 810000；3.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730030）

膝關節骨關節炎（Knee Osteoarthritis,KOA）在骨關節炎（Osteoarthritis，OA）中最為常見，是一種常見的慢性炎癥性關節病，其特征是由不平衡的軟骨合成代謝和分解代謝引起的生化和形態學改變，是老年人群疼痛和殘疾的主要原因，約占OA 的78.5%[1]。隨著時間的延長，膝關節表面的軟骨出現退行性病變，易導致膝關節骨關節炎的發生，表現以膝關節軟骨變性破壞并伴有膝關節部位局限性或彌散性疼痛、晨僵、膝關節腫脹、行走時出現嵌頓等臨床癥狀，不僅對患者健康造成損傷，而且造成了嚴重的社會問題。其病理改變與病程發展與患者的年齡成正相關。在50～80 歲的人群中，女性發病率超過男性[2]。在40～60 歲的人群中，影像學顯示膝關節骨關節炎患者占30%左右，在60 歲以上的人群中，這一數值急劇上升，大約為85%[3]。并且其態勢愈發加重。MAPKs 信號通路與膝關節軟骨細胞凋亡和滑膜組織破壞存在密切關系，本研究就MAPKs 信號通路，以及此信號通路與膝關節骨關節炎的關系問題及研究進展做一綜述。

1 MAPKs 家族

MAPKs 介導的信號通路是從細胞表面到細胞核的主要信號通路。這些信號級聯控制復雜的程序，例如胚胎發生、分化、增殖和細胞死亡。哺乳動物中存在三大類MAPK，即細胞外信號調節激酶（ERK）、c-jun N-末端激酶（JNK）和p38。ERK 被有絲分裂原和生長因子激活，而JNK 和p38 MAPK被激活以響應炎性細胞因子TNFα 和IL-1 以及細胞應激，如熱應激、滲透應激、活性氧代謝物和紫外線輻照等[4]。

MAPKs 介導的信號通路為細胞損傷和應激反應的重要信號通路，MAPKs 家族的信號通路主要包括4 條：ERK1/2（Extracellular Signal-regulated Kinase1/2）蛋白激酶信號通路、JNK（c-Jun N-terminal in ase stress-activated protein Kinase）端激酶通路、p38 MAPK（p38 Mitogen Activated Protein Kinases）通路及ERK5 通路，以及三個非典型MAPK 亞組：ERK3/4、ERK7/8 和Nemo-Like 激酶（NLK），其中ERK1/2蛋白激酶信號通路、JNK 激酶信號通路及p38 MAPK激酶信號通路與膝關節骨關節炎存在密切關系[5]。

ERK1/2 蛋白激酶信號通路可以控制細胞的增殖、分化和凋亡[6]，ERK1/2 在細胞凋亡中存在兩副面孔，可進行雙向調節，Liu 等[7]認為ERK1/2 可通過轉錄及翻譯機制上下調節促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，從而達到抵抗細胞凋亡效果。Yue 等[8]發現ERK1/2 在細胞周期停滯和細胞周期重新進入均可激活誘導細胞凋亡，不同的損傷可通過激活ERK1/2 介導的信號通路，誘導細胞失活凋亡。JNK 信號通路可在多種炎性因子、細胞外刺激及應激反應的情況下通過生發激酶（GCK）、細胞凋亡調節激酶（ASK）從而進行誘導細胞凋亡[9]。Wagner 等[10]認為JNK 通過下調凋亡蛋白表達和相關DNA 轉錄的方式誘導細胞凋亡。

p38 MAPK 信號通路是細胞內重要的傳遞者，由p38（α、β、γ、δ）四部分組成[11]。p38 MAPK 信號通路的介導在上端激酶和半胱天冬酶-3 蛋白參與進行。p38 MAPK 的激活導致由維甲酸、順鉑和其他化療劑引發的癌細胞凋亡。人的大隱靜脈中的機械拉伸誘導p38 MAPK 的激活，這與細胞凋亡有關。氧化應激誘導的p38 MAPK 磷酸化與多巴胺能神經元中半胱天冬酶9 介導的凋亡途徑的激活有關。p38 MAPK 抑制劑可減少凋亡細胞的數量并防止少突膠質細胞受損區域的延遲進行性退化[12]。此外，Pelletier 等[13]報道，實驗性骨關節炎中的軟骨細胞死亡是由p38 MAPK 通路介導的。p38 MAPK 信號轉導通路也被認為是一氧化氮誘導的兔關節軟骨細胞凋亡的關鍵因素。p38 MAPK 在應激誘導的關節軟骨細胞凋亡中起重要作用，而p38 MAPK 的下調可能有助于軟骨細胞凋亡的減少。

p38 MAPK 激酶信號通路因細胞外刺激（炎性因子、生物力學方面等）因素得到激活，產生磷酸化反應，其在膝關節骨關節炎軟骨細胞中活化，可對p38 MAPK 信號通路活性進行抑制，達到抵抗膝關節軟骨細胞凋亡與退變的作用，被評價為OA 病變程度的特異性指標。Rossenzweig 等[14]增加發現通過對p38 MAPK 激酶信號通路的抑制，可促使軟骨細胞活化再生，改善關節軟骨的退變。除此之外，p38 MAPK 激酶信號通路對軟骨細胞的去分化可起到促進作用，抑制其成纖維化。

2 MAPKs 信號通路與膝關節骨關節炎

MAPKs 介導的信號通路在細胞內通過磷酸化得到激活，隨后ERK1/2 蛋白激酶信號通路在雙磷酸化的作用下得到激活[15]。ERK1/2 蛋白激酶信號通路也是MAPKs 家族中最早被發現的，JNK 激酶信號通路及p38 MAPK 激酶信號通路認為是在應激作用下進行介導。Attur 等[16]和Fernandes 等[17]發現在膝關節骨關節炎的病程中，其軟骨細胞和滑膜組織中白介素1 和腫瘤壞死因子α 等炎性因子在對膝關節軟骨細胞的破壞以及修復細胞失衡的過程中起決定作用，并通過對關節軟骨細胞中金屬基質蛋白酶(matrix metal loproteinases,MMPs）活化上調，進一步抑制蛋白多糖的合成，加快基質降解。在此過程中ERK1/2 蛋白激酶信號通路、JNK 激酶信號通路及p38 MAPK 激酶信號通路均參與了此病理改變的介導，由此可知MAPKs 信號通路與膝關節骨關節炎存在密切關系，但上述3 種信號通路存在時相差異，說明其介導機制存在個體化差異。

2.1 MAPKs 信號通路導致軟骨細胞的凋亡

楊豐建等[18]發現OA 動物模型中，4 周組、8 周組、12 周組的家兔關節軟骨破壞程度與病變時間成正比例上升；磷酸化的ERK1/2 信號通路激酶水平病程初期就得到快速活化，并迅速上升，維持較高的基礎水平，說明ERK1/2 信號通路在關節軟骨細胞的破壞與正常生長中有著不可或缺的作用。應激激活的JNK 激酶信號通路和p38 MAPK 激酶信號通路在細胞外和細胞內應激的平衡細胞存活和死亡中起關鍵作用，這兩者均可介導促凋亡過程。從Yoon等[19]實驗中得知，膝關節軟骨細胞在經MAPK 磷酸化處理后，被激活的JNK 激酶信號通路在生長因子的誘導下，其活性時長增加，并導致關節軟骨細胞凋亡。

Liu 等[20]通過建立OA 的大鼠模型。此外，向OA大鼠注射不同劑量的重組CTRP9 蛋白（rCTRP9），并評估膝關節軟骨損傷。最后通過蛋白質印跡和酶聯免疫吸附測定法檢測p38 的磷酸化和基質金屬蛋白酶（MMPs）的分泌。結果顯示，CTRP9 在脂肪組織中表達高度。其次是骨骼肌和軟骨組織，在肝臟，腎臟和肺部表達較少。此外，碘乙酸單鈉（MIA）組在膝關節軟骨和膝關節滑液中CTRP9 的表達顯著降低，膝關節滑液中白細胞介素-1β（IL-1β）和IL-6的含量顯著增加。此外，rCTRP9 以劑量依賴性方式緩解了MIA 誘導的炎癥，氧化應激和膝關節軟骨損傷。此外，rCTRP9 可以減弱p38MAPK 和p-p38 的表達，抑制核因子-kappa B（NF-κB），p65 和MMPs的表達。研究結果表明，CTRP9 通過停用大鼠p38 MAPK 和NF-κB 信號通路來緩解MIA 誘導的OA的炎癥。

2.2 MAPKs 信號通路促進成骨細胞的分化

Liu 等[20]使用永生化小鼠成牙骨質細胞系OCCM-30。通過qRT-PCR 評估用礦物誘導培養基培養的細胞中的成牙骨質分化標志物和PGC-1α，通過茜素紅染色評估成牙骨質礦化，通過qRT-PCR 或蛋白質印跡分析評估鳶尾素刺激下的分化標志物和p38 MAPK 途徑的活性。p38 MAPK 通路抑制劑SB203580 或p38 siRNA 用于進一步鑒定調控機制，用CCK-8 法檢測鳶尾素處理的細胞增殖情況。在礦物質誘導下，Runx2、osterix、ALP 和PGC-1α 的表達持續上調。鳶尾素增加了礦化結節的形成。發現Runx2,osterix,鳶尾素刺激下ALP 和骨鈣素明顯上調，p38 MAPK 通路活性明顯升高。在鳶尾素刺激前用SB203580 或p38 siRNA 預處理時，鳶尾素誘導的分化明顯受到抑制。長期高劑量鳶尾素處理OCCM-30 細胞增殖增強。說明鳶尾素可通過p38 MAPK 通路促進成牙骨質細胞的分化。

張鳳等[21]通過構建大鼠OA 模型，治療組選用鳶尾素，檢測出四個實驗組中組白細胞介素1 和白細胞介素6 水平以及軟骨組織中p38 蛋白磷酸化水平均低于其他三個治療組，說明鳶尾素可以通過調控TDP-43/p38 MAPK 抑制炎性反應，從而緩解軟骨損傷。

2.3 MAPKs 信號通路可調節microRNA

Zhang 等[21]進行逆轉錄-定量聚合酶鏈反應和蛋白質印跡以確定miR-27a-3p 和聚集蛋白聚糖酶2 (ADAMTS5）在OA 患者和健康對照的軟骨組織中的表達，以及在白細胞介素(IL）中的表達。結果顯示，與正常對照相比，OA 軟骨組織中miR-27a-3p 的水平降低。此外，在用IL-1β 處理的軟骨細胞中，以時間和劑量依賴性方式觀察到miR-27a-3p降低和ADAMTS5 表達增加。此外，miR-27a-3p 的過表達抑制了IL-1β 誘導的人軟骨細胞中ADAMTS5 的表達。miR-27a-3p 過表達也降低了野生型 ADAMTS5 報告質粒的熒光素酶活性。ADAMTS5 mRNA 3'-非翻譯區中miR-27a-3p 結合位點的突變消除了miR-27a-3p 介導的報告活性抑制。此外，特異性抑制劑的使用表明IL-1β 可通過軟骨細胞中的 NF-κB 和MAPK 信號通路調節miR-27a-3p 的表達。本研究得出結論，miR-27a-3p 在人類OA 中下調并被IL-1β 抑制，并且在OA軟骨細胞中作為ADAMTS5 的關鍵調節因子發揮作用。此外，IL-1β 介導的miR-27a-3p 活性抑制可能通過MAPK 和NF-κB 途徑發生。為臨床治療由miR-27a-3p 上調引起的OA 提供一種新策略。

2.4 MAPKs 信號通路可抑制破骨細胞增殖

MAPKs 信號通路與破骨細胞的過度增殖或分化有關。Zhang 等[22]原兒茶酸（PCA）對前交叉韌帶橫斷（ACLT）誘導的OA 的影響以及該效應背后的潛在作用機制。在大鼠上進行ACLT，然后用或不用PCA 進行治療。通過ELISA 在膝關節蛋白提取物中測試I 型膠原（CTX-I）和CTX-II 的C 端特洛肽。使用Safranin-O/ Fast Green 染色評估軟骨損傷。通過逆轉錄定量PCR 和蛋白質印跡評估破骨細胞相關基因和蛋白表達。使用RAW264.7 小鼠巨噬細胞進行酒石酸耐酸磷酸酶（TRAP）染色和功能性骨吸收坑測定，以確定PCA 對破骨細胞形成和體外功能的影響，通過蛋白質印跡評估了破骨細胞發生相關信號通路的活性。CTX-II 水平相對降低，Safranin-O/快速綠色染色表明PCA 治療組的關節軟骨變化較輕。PCA 下調破骨細胞特異性標志物和抑制核因子-κB 配體的受體激活劑誘導的TRAP 陽性多核細胞的形成，骨吸收和凹坑形成。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和Akt 信號傳導以及下游因子被PCA 下調。研究表明，PCA 通過抑制MAPK，ATK 和NF-κB信號通路來抑制破骨細胞生成，從而減弱ACLT 誘導的OA。

3 研究意義與展望

膝關節骨關節炎患者人數隨社會的發展日益增多，對膝關節骨關節炎的防治已然成為醫學界焦點問題。通過上述對MAPKs 信號通路家族介紹可知，對MAPKs 信號通路的抑制，可以達到抑制或延緩膝關節軟骨細胞凋亡與滑膜組織破壞進程，以及促進軟骨細胞修復的效果。MAPKs 信號通路可導致軟骨細胞的凋亡，促進成骨細胞的分化，可抑制破骨細胞增殖，可調節microRNA 等功能。

臨床上目前有鳶尾素、原兒茶酸、黃芩素、姜黃素、HDAC 抑制劑等通過抑制MAPKs 中某一項信號通路，對膝關節骨關節炎進行相關防治[23]，但僅通過某一項信號通路介導，作用于單個靶點，對抑制膝關節骨關節炎的發展并未能達到預期效果[24]，因為在其病理改變過程中有多條信號通路積極參與其中，另外黃芩素、姜黃素、HDAC 抑制劑中存在有相關靶點與療效的可靠性尚未明確問題，對膝關節骨關節炎的防治仍然任重道遠。