二重熒光RT-LAMP對牛病毒性腹瀉病毒和牛輪狀病毒的鑒別診斷

范 晴，謝芝勛，謝志勤，謝麗基，黃嬌玲，張艷芳，曾婷婷，王 盛，羅思思 (廣西獸醫研究所 廣西獸醫生物技術重點實驗室，廣西 南寧 530001)

牛輪狀病毒(bovine rotavirus，BRV)和牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea disease virus,BVDV)是2種常見牛腹瀉病毒，癥狀相似，難以區分。BVDV臨床上常出現發熱、腹瀉、黏膜損傷和趾部損傷，但大多數感染BVDV的牛為持續性感染且不表現臨床癥狀，一旦再次接觸相似性抗原便會繼發為黏膜病，病死率100%。持續感染的牛可通過血液、排泄物等多種途徑水平傳播病毒，還可通過生殖道垂直傳播，且終身帶毒，持續排毒，成為牛場腹瀉癥的重要傳染源，對養牛業存在潛在危害。BRV主要感染1～30日齡初生犢牛，可引起犢牛腹瀉、脫水、嘔吐和酸堿平衡[1-4]。2種病毒經常混合感染，感染后病程加重，我國每年因腹瀉病引起的經濟損失高達數億元，因此急需建立這2種病的快速檢測技術，為我國BRV和BVDV的防控提供技術支持。

目前常用的診斷方法主要有血清學方法、病原分離和分子生物學方法(RT-PCR和熒光RT-PCR)[5-8]。環介導恒溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種基于PCR發展起來的新興核酸擴增技術，它解決了PCR多溫度擴增的技術難點，采用恒溫擴增，6條引物(針對8個區域)同時擴增效率增加、敏感性高、特異性好，經常應用于疾病診斷及基因篩選[9-12]。多重LAMP是一種高效的LAMP形式，一次LAMP反應，可同時檢測、鑒別多種病原體。但目前國內的多重LAMP方法都有一定的局限性，不能準確地檢測是哪一種病原引起的陽性結果，都沒有實現真正意義上的鑒別診斷。本研究建立的BRV和BVDV二重RT-LAMP方法，在LAMP引物中標記熒光基團，反應后通過擴增產物的顏色讀取反應結果，可準確鑒別診斷BVDV和BRV兩種病毒。……