基于新城疫病毒NP蛋白的間接ELISA抗體檢測方法的建立

賈妙妙，王國康，李 麗，王紅琳，羅青平，邵華斌，曾 馳，溫國元* (1.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 43003；.湖北省農業科學院 畜牧獸醫研究所/農業部畜禽細菌病防治制劑創制重點實驗室/湖北省畜禽病原微生物學重點實驗室，湖北 武漢，430064)

NP蛋白是含量最為豐富和保守性最高的病毒結構蛋白，其基因全長約為1.7 kb，開放閱讀框長度1.47 kb，共編碼489個氨基酸，相對分子質量為53 kDa。NP與L和P蛋白相互協作，調控病毒基因組的復制與轉錄[14]。NP蛋白的N端結合RNA，高度保守，其C端含有磷酸化位點和抗原決定簇位點。NP蛋白具有較強的免疫原性，但不具有免疫保護作用[15]。本研究采用原核表達系統，表達純化NDV NP蛋白，以其為包被抗原，建立基于NP蛋白的NDV間接ELISA抗體檢測方法，進一步分析其敏感性、特異性、重復性及其與HI檢測方法的符合率，旨在為該方法的臨床應用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 毒株、血清和載體NDV LaSota株和6種禽類病原的陽性血清，包括NDV、H9亞型禽流感病毒(AIV)、J亞群禽白血病病毒(ALV-J)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、禽大腸桿菌和沙門菌，均由本實驗室保存。30份NDV陰性血清采集自1月齡SPF雞。200份雞血清樣品采集自湖北、山東、河南和江蘇省養殖場。原核表達宿主菌E.coliBL21-CodonPlus(DE3)和表達質粒pET-30a購自德泰生物科技有限公司。

1.2 主要試劑病毒RNA提取、DNA回收和質粒提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司；RT-PCR反應試劑、T4DNA連接酶和Taq DNA聚合酶購自寶生物工程有限公司；Ni-IDA瓊脂糖凝膠購自德泰生物科技有限公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；……