我國健康豬源大腸桿菌對(duì)四環(huán)素類藥物耐藥性的Meta分析

周玲，猶銀俊，龔才偉，呂世明*，譚艾娟，鄭汝青，王劍，廖書丹

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.黔南州養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中心動(dòng)物疫病預(yù)防控制站，貴州 黔南 558000；3.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽 550025)

大腸桿菌(Escherichiacoli)是人和動(dòng)物腸道內(nèi)的共生菌及機(jī)會(huì)致病菌[1]。該菌與多種藥物及多種細(xì)菌接觸可形成或獲得耐藥性，再與其他細(xì)菌接觸時(shí)可將耐藥遺傳因子轉(zhuǎn)移出去，是潛在的耐藥基因儲(chǔ)存庫，因此這些與健康動(dòng)物共生的大腸桿菌被認(rèn)為是耐藥性的指示菌[2]。

四環(huán)素類抗生素(tetracyclines)因價(jià)格低廉且毒性較低的優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)，經(jīng)查閱2000年至2020年的大量文獻(xiàn)，從我國養(yǎng)殖場動(dòng)物中分離鑒定的大腸桿菌已對(duì)四環(huán)素類藥物產(chǎn)生耐藥性，但在時(shí)間、地區(qū)上零散不系統(tǒng)。Meta分析是指采用統(tǒng)計(jì)方法，將多個(gè)獨(dú)立的的小型研究采用嚴(yán)格、系統(tǒng)的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)、分析和合成[3]，可以避免單個(gè)小樣本臨床試驗(yàn)的局限性，使結(jié)果更全面和可靠。故本研究期望通過Meta分析方法對(duì)健康豬源大腸桿菌四環(huán)素類藥物耐藥狀況進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，并探討耐藥性與時(shí)間、空間分布的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 搜索和選擇標(biāo)準(zhǔn)

檢索PubMed、EMBASE、EBSCO、Web of science、MD Consult(ClinicalKey)、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(SinoMed)、中國國家知識(shí)基礎(chǔ)設(shè)施(CNKI)、萬方(中國)數(shù)據(jù)庫、維普數(shù)據(jù)庫、谷歌學(xué)術(shù)共10個(gè)數(shù)據(jù)庫，確定2000年1月1日至2020年1月13日發(fā)布的中國豬源大腸桿菌耐藥性的研究文獻(xiàn)。以豬源大腸桿菌及抗菌藥物耐藥性作為相關(guān)檢索詞。檢索詞：大腸桿菌、耐藥性、藥物、動(dòng)物。這些術(shù)語與文本搜索相結(jié)合，包括：大腸桿菌、抗菌藥物耐藥性、多重耐藥性、四環(huán)素類和豬。在英文文獻(xiàn)中，檢索詞需要添加“中國”，因?yàn)橛⑽奈墨I(xiàn)中會(huì)報(bào)道其他國家。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)如下：可以獲得大腸桿菌四環(huán)素耐藥率的文獻(xiàn)；可獲得大腸桿菌菌株總數(shù)(或可用于計(jì)算它們的數(shù)據(jù))的文獻(xiàn)；發(fā)表日期為2000年1月1日至2020年1月13日的文獻(xiàn)；原始研究文獻(xiàn)；關(guān)于動(dòng)物的報(bào)告。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn)如下：菌株不是來自健康動(dòng)物，而是來自患病動(dòng)物或病料的文獻(xiàn)；沒有使用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測耐藥性、沒有報(bào)告樣本量或數(shù)據(jù)不適當(dāng)?shù)奈墨I(xiàn)；在耐藥性檢測前，大腸桿菌菌株通過其他標(biāo)準(zhǔn)預(yù)先選擇，如含有某些基因等文獻(xiàn)；大腸桿菌菌株數(shù)少于3株的文獻(xiàn)；市場豬肉來源、豬場環(huán)境來源的文獻(xiàn)；重復(fù)數(shù)據(jù)的文獻(xiàn)；不是來自豬，來自于其他動(dòng)物的文獻(xiàn)；日期范圍之外的文獻(xiàn)；綜述及統(tǒng)計(jì)分析的文獻(xiàn)。

1.3 文獻(xiàn)信息摘錄

閱讀從數(shù)據(jù)庫中檢索出來文獻(xiàn)的題目、摘要，根據(jù)納入條件進(jìn)行文獻(xiàn)初步篩選；然后通過閱讀全文，根據(jù)排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行第二次篩選。用Excel表摘錄下第一作者、發(fā)表時(shí)間、樣本量、耐藥菌株數(shù)、研究地區(qū)、耐藥率、試驗(yàn)方法、評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)等關(guān)鍵信息。

1.4 文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)

根據(jù)Ali等[4]的研究，以及Joanna Briggs Institute推薦的批判性評(píng)估檢查表[5]進(jìn)行研究質(zhì)量評(píng)估。檢查表由7個(gè)問題組成，每題回答“是”得1分，問題4有2分。每項(xiàng)研究的最終分?jǐn)?shù)在0到8之間。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)收集及基礎(chǔ)計(jì)算，使用Revman 5.3軟件在該薈萃分析中進(jìn)行合并，參照陳月紅等[6]的方法進(jìn)行最終結(jié)果轉(zhuǎn)換，效應(yīng)值、95%置信區(qū)間上限與下限的轉(zhuǎn)換值即是最終所需要的耐藥率合并值及其95%置信區(qū)間。公式為：效應(yīng)量的轉(zhuǎn)換值=效應(yīng)量/(1+效應(yīng)量)；95%置信區(qū)間下限的轉(zhuǎn)換值=95%置信區(qū)間下限值/(1+95%置信區(qū)間下限值)；95%置信區(qū)間上限轉(zhuǎn)換值=95%置信區(qū)間上限值/(1+上限值95%置信區(qū)間)。基于顯著異質(zhì)性的可能性，使用卡方檢驗(yàn)來估計(jì)研究之間的異質(zhì)性，若P>0.10，則認(rèn)為沒有異質(zhì)性，采用固定效應(yīng)模型(F)；若P<0.10，則認(rèn)為研究間具有異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型(R)。0%

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果

用計(jì)算機(jī)檢索了10個(gè)電子數(shù)據(jù)庫，結(jié)果見圖1。

圖1 文獻(xiàn)檢索及篩選流程

由圖1可見，檢索PubMed 7篇、EMBASE 3篇、EBSCO 24篇、Web of Science 149篇、MD Consult(ClinicalKey)14篇、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(SinoMed)141篇、中國國家知識(shí)基礎(chǔ)設(shè)施(CNKI)40篇、萬方(中國)數(shù)據(jù)庫281篇、維普數(shù)據(jù)庫4篇、Coogle Scholar 5篇，共確定了從2000至2020發(fā)表的668篇文獻(xiàn)。在對(duì)標(biāo)題和摘要進(jìn)行初步評(píng)價(jià)后，排除了547篇不相關(guān)和重復(fù)的文章，其余121篇文章進(jìn)行全文瀏覽。121篇文獻(xiàn)在瀏覽后，有101篇被排除在外，具體原因有：34篇樣本來自患病動(dòng)物，32篇沒有使用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測耐藥性、沒有報(bào)告樣本量或數(shù)據(jù)不恰當(dāng)?shù)难芯浚?6篇信息不完整的研究，9篇市場豬肉來源或環(huán)境樣本來源，4篇文獻(xiàn)使用重復(fù)數(shù)據(jù)，3篇文獻(xiàn)菌株已經(jīng)通過篩選，1篇不在時(shí)間范圍以內(nèi)，1篇來自其他動(dòng)物，1篇不是原始研究。經(jīng)篩選后，最后納入20篇文獻(xiàn)進(jìn)行Meta分析。

2.2 納入研究的基本特征和偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

對(duì)經(jīng)篩選后納入的20篇研究基本情況及質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)得分，見表1。

表1 納入文獻(xiàn)基本情況及質(zhì)量評(píng)分

2.3 Meta分析

2.3.1 健康豬源大腸桿菌四環(huán)素類藥物耐藥率

對(duì)20篇文獻(xiàn)分不同抗菌藥物進(jìn)行耐藥率的合并，由于異質(zhì)性較大(I2>50%)，均采用隨機(jī)效應(yīng)模型。在四環(huán)素耐藥率的分析上，對(duì)異質(zhì)性影響較大的研究進(jìn)行單個(gè)逐步剔除，并仔細(xì)閱讀原文發(fā)現(xiàn)，3篇研究[11,13,23]均是來自散養(yǎng)模式喂養(yǎng)的豬群，其耐藥率明顯低于集中飼養(yǎng)的規(guī)模化養(yǎng)豬場，對(duì)異質(zhì)性有較大影響。而1篇研究[26]原文顯示采集樣本為2014至2016年，發(fā)表時(shí)間為2018年；在納入文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)中為最低分4分；與同組類其他文獻(xiàn)存在較大異質(zhì)性，此處不予合并。豬源大腸桿菌四環(huán)素類藥物的耐藥數(shù)據(jù)進(jìn)行分別合并分析后，經(jīng)過用文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)換，最終轉(zhuǎn)化后的結(jié)果見表2顯示。耐藥率由高到低依次是：土霉素97.0%(95%置信區(qū)間為90.8%～99.1%,P<0.01)、金霉素94.7%(95%置信區(qū)間為91.9%～97.5%,P<0.01)、四環(huán)素93.5%(95%置信區(qū)間為90.8%～95.3%,P<0.01)、強(qiáng)力霉素74.4%(95%置信區(qū)間為58.5%～85.7%,P<0.01)、地美環(huán)素70.6%(95%置信區(qū)間為63.1%～77.2%)、替加環(huán)素34.2%(95%置信區(qū)間為31.0%～37.5%)、米諾環(huán)素33.2%(95%置信區(qū)間為3.9%～62.4%,P=0.03)。

表2 健康豬源大腸桿菌四環(huán)素類藥物的耐藥情況

2.3.2 健康豬源大腸桿菌四環(huán)素耐藥率的亞組分析

對(duì)符合條件的17項(xiàng)有關(guān)大腸桿菌對(duì)四環(huán)素耐藥的研究共3 796株菌株做亞組分析，分別形成不同地區(qū)、不同省份、不同時(shí)間段的亞組分析，結(jié)果如表3所示。在四環(huán)素耐藥的亞組分析上，對(duì)包含4個(gè)以上的研究存在異質(zhì)性，則尋找異質(zhì)性來源，進(jìn)行敏感性分析發(fā)現(xiàn)，在四環(huán)素耐藥率的亞組分析上，從地理分區(qū)來看，除未收集到數(shù)據(jù)的西北外，耐藥率從高到低依次是華北99.3%(95%置信區(qū)間為95.0%～99.9%)、華中95.1%(95%置信區(qū)間為82.5%～98.8%)、華北與華中94.1%(95%置信區(qū)間為86.6%～97.6%)、華東92.8%(95%置信區(qū)間為90.2%～94.8%)、華南88.6%(95%置信區(qū)間為71.8%～96.0%)、西南88.4%(95%置信區(qū)間為31.0%～99.2%)、東北87.3%(95%置信區(qū)間為81.8%～91.3%)，耐藥率均高于80%，而華北耐藥率最高達(dá)99.3%；從不同省份來看，除西藏自治區(qū)耐藥率低于50%，為40.5%(95%置信區(qū)間為32.4%～49.0%)；其余上海市、廣東省、山東省、貴州省、福建省、江蘇省、北京市、吉林省、河南省、北京市與湖北省組共10省的耐藥率均超過80%，北京市耐藥率最高，為99.3%(95%置信區(qū)間為95.0%～99.9%)；從時(shí)間段來看，2005至2010、2011至2015、2016至2020分別為94.5%(95%置信區(qū)間為88.9%～97.4%)、92.3%(95%置信區(qū)間為89.4%～94.5%)、96.3%(95%置信區(qū)間為93.0%～98.1%)。

表3 健康豬源大腸桿菌四環(huán)素藥物耐藥率的亞組分析表

2.3.3 健康豬源大腸桿菌強(qiáng)力霉素耐藥率亞組分析

對(duì)符合條件的9項(xiàng)有關(guān)大腸桿菌對(duì)強(qiáng)力霉素耐藥的研究共2 696株菌株做亞組分析，分別形成不同地區(qū)、不同省份、不同時(shí)間段的亞組分析，結(jié)果如表4所示。在強(qiáng)力霉素耐藥率的亞組分析上，從地理分區(qū)來看，除未收集到數(shù)據(jù)的西北、東北外，耐藥率從高到低依次是華北98.4%(95%置信區(qū)間為24.0%～100%)、華中78.1%(95%置信區(qū)間為63.0%～88.2%)、西南76.6%(95%置信區(qū)間為54.5%～90.0%)、華南68.3%(95%置信區(qū)間為55.8%～78.5%)、華東61.1%(95%置信區(qū)間為29.0%～85.9%)，耐藥率均高于50%，而華北耐藥率最高達(dá)98.4%。從不同省份來看，貴州省、福建省、上海市、河北省、廣東省、河南省、四川省7省的耐藥率均超過50%；河北省耐藥率最高，都為100.0%(95%置信區(qū)間為83.0%～100.0%)；廣東省、上海市耐藥率較低，分別為68.3%(95%置信區(qū)間為55.8%～78.5%)、59.3%(95%置信區(qū)間為10.7%～94.6%)。從時(shí)間段來看，2011至2015與2016至2020分別為74.4%(95%置信區(qū)間為51.0%～89.0%)、75.7%(95%置信區(qū)間為47.6%～91.4%)。

表4 健康豬源大腸桿菌強(qiáng)力霉素耐藥率的亞組分析表

2.3.4 漏斗圖

漏斗圖是一種以視覺觀察來識(shí)別是否存在發(fā)表偏倚的方法。小樣本所得的離散度較大，常處于漏斗圖的底部；大樣本離散度較小，處于頂部。健康豬源大腸桿菌對(duì)四環(huán)素耐藥率漏斗圖基本對(duì)稱(圖2)，顯示樣本量較大且偏倚較小。

圖2 健康豬源大腸桿菌對(duì)四環(huán)素耐藥率的漏斗圖

3 討論

我國畜牧業(yè)生產(chǎn)中使用抗菌藥始于20世紀(jì)70年代，并且于2017年開始施行“減抗”計(jì)劃，2020年成為我國飼料全面強(qiáng)制性禁抗的起點(diǎn)。健康動(dòng)物體內(nèi)共生性大腸桿菌作為耐藥指示菌和耐藥基因儲(chǔ)存庫，對(duì)其進(jìn)行耐藥性監(jiān)測尤為重要。有研究表明，來源于患病動(dòng)物的大腸桿菌耐藥性高于健康動(dòng)物[27-29]。

本研究對(duì)健康豬源大腸桿菌抗四環(huán)素類藥物耐藥率的Meta分析發(fā)現(xiàn)：四環(huán)素類藥物耐藥率從高到低依次是：土霉素、金霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、地美環(huán)素、替加環(huán)素。替加霉素耐藥水平最低，為34.2%。從相關(guān)機(jī)制分析，細(xì)菌在體外時(shí)對(duì)四環(huán)素的耐藥性產(chǎn)生較慢,但體內(nèi)同種之間會(huì)呈交叉耐藥[30]，以致耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。何濤等[31]研究新型變異體tet(X)可介導(dǎo)一二代四環(huán)素類藥物耐藥；孫堅(jiān)等[32]研究tet(X4)基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌能顯著增強(qiáng)其對(duì)所有四環(huán)素的耐藥性。同時(shí)，由于耐藥基因能通過質(zhì)粒傳播[33]，有很高的可移動(dòng)性，所以在較強(qiáng)的藥物選擇壓力下可能促進(jìn)耐藥性在食物鏈及環(huán)境中傳播，造成耐藥嚴(yán)重。因此，養(yǎng)殖業(yè)應(yīng)少用四環(huán)素類藥物，可使用抗生素替代品。亞組分析結(jié)果顯示，我國健康豬源大腸桿菌四環(huán)素、強(qiáng)力霉素耐藥率在各地區(qū)、各省份存在差異性，耐藥狀況嚴(yán)重；在不同時(shí)間段中，隨時(shí)間的推移耐藥率沒有明顯下降。本研究存在一定局限性，因沒有獲得足夠數(shù)量的不同年份的四環(huán)素類藥物耐藥率的研究，故無法詳細(xì)跟蹤了解四環(huán)素類藥物耐藥率隨年限的變化。

本研究異質(zhì)性較大與以下因素有關(guān)：第一，受研究分析因子的設(shè)定影響，如不同研究所選用的豬場、抽樣方法及樣本量不同均對(duì)豬源大腸桿菌四環(huán)素類藥物合并耐藥率的結(jié)果造成影響。還有各原始文獻(xiàn)為單個(gè)組別的率，屬觀察性研究，不能實(shí)現(xiàn)隨機(jī)化，穩(wěn)定性不同于兩個(gè)組的研究，更容易受到偏倚風(fēng)險(xiǎn)的影響，所以在合并時(shí)統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性一般會(huì)比較大，國內(nèi)發(fā)表的很多關(guān)于單個(gè)率的Meta分析也可證實(shí)這一點(diǎn)[34]。第二，受不同地區(qū)豬場的數(shù)量、規(guī)模、分布等差異的影響。華中、華南和東北地區(qū)養(yǎng)殖規(guī)模大，其藥物使用量也大，導(dǎo)致該區(qū)域?qū)λ沫h(huán)素、強(qiáng)力霉素的耐藥率較高。第三，與使用時(shí)間長短有關(guān)，上世紀(jì)70年代常用的飼料添加劑就包括土霉素，四環(huán)素、金霉素等，因此，大腸桿菌對(duì)這些抗生素顯示了較高的耐藥性，應(yīng)用較晚的替加環(huán)素及不常使用的米諾環(huán)素在養(yǎng)殖場并沒有很高的耐藥水平，藥物的使用時(shí)間差異也會(huì)影響研究結(jié)果。第四，與飼養(yǎng)模式有關(guān)，如孫理云等[24]的研究，在異質(zhì)性分析中發(fā)現(xiàn)，對(duì)于散養(yǎng)模式的豬群，其耐藥率明顯低于集中規(guī)模化飼養(yǎng)的豬群。本研究還存在許多不足：研究是單組變量的Meta分析；缺乏對(duì)照設(shè)計(jì)；養(yǎng)殖場飼養(yǎng)模式等因子未納入研究；某些亞組分析包含的文獻(xiàn)數(shù)量較少，納入的文獻(xiàn)調(diào)查地區(qū)來源部分地區(qū)，這些對(duì)結(jié)果都可能存在一定影響。