甲型流感病毒與NLRP3炎性小體激活的研究進展

潘文亮，江寧，王松，邱世昕

(福建農林大學動物科學學院(蜂學學院)/閩臺動物病原生物學福建省高校重點實驗室，福建 福州 350002)

甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)長期以來對公共衛生安全和畜牧業造成了全球性的威脅，廣泛地導致人類與畜禽的死亡，值得注意的是1918至1920年由H1N1病毒引起的“西班牙流感”大流行，據研究估計感染造成5千萬至1億人死亡；1957年的H2N2病毒造成超過200萬人死亡，1968年的H3N2病毒殺死了約100萬人[1-2]。禽類感染的甲型流感病毒H5N1和H7N9均可傳染給人類，H5N1致死率在60%，H7N9致死率在20%左右，但是其相對于H5N1而言具有更高的傳播速度[3]，所以闡釋甲型流感病毒的致病機理在對其預防和治療方面尤為重要。甲型流感病毒感染所引發的嚴重疾病和造成的死亡，與宿主體內異常或者失調的細胞因子、以及炎癥反應有關[4]。細胞因子NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎性小體是一種宿主天然免疫的蛋白復合物，其與病毒感染時大量促炎細胞因子分泌并造成細胞因子風暴，進而誘發過度炎癥反應有密切的關聯。本文闡述了 NLRP3 炎性小體在甲型流感病毒感染中的作用和現今研究發展，為甲型流感病毒感染引發的細胞因子風暴提供潛在的治療方向。

1 甲型流感病毒

流感病毒屬于正黏病毒科家族(Orthomyxoviridae)，分為甲、乙、丙、丁或A、B、C、D四型。甲型和乙型流感病毒為具有8個基因組片段的單鏈負股RNA病毒，編碼10種必需的病毒蛋白，包含血凝素(hemagglutinin，HA)、神經氨酸酶(neuramidinase，NA)、核蛋白(nucleoprotein，NP)、非結構蛋白1(non-structural protein 1，NS1)、非結構蛋白2(nonstructural protein 2，NS2)、基質蛋白1(matrix protein 1，M1)、基質蛋白2(matrix protein 2，M2)、聚合酶堿性蛋白1(polymerase basic protein 1，PB1)、聚合酶堿性蛋白2(polymerase basic protein 2，PB2)和聚合酶酸性蛋白(polymerase acid protein，PA)，以及若干個輔助蛋白轉錄本，例如與病毒毒力密切相關的非結構蛋白PB1-F2蛋白等[5-6]。另外，丙型和丁型流感病毒的遺傳物質由7個基因組片段組成，在病毒表面表達血凝素酯酶融合(hemagglutinin esterase fusion，HEF)蛋白來代替HA和NA[7]。其中，甲型流感病毒是導致人類以及畜禽流感大流行的主要病原，因此得到了廣泛的研究。

甲型流感病毒基因組長約1.35萬個堿基，由8個片段組成，能夠編碼10種必需的病毒蛋白，根據HA和NA蛋白的分子結構和遺傳特征，在人類、畜禽等宿主中發現有16種HA亞型和9種NA亞型，且近年來在蝙蝠體內檢測出H17N10和H18N11[8]。在一種甲型流感病毒與其他不同來源的流感病毒株共同感染情況下，可能會導致病毒抗原轉移，從而產生全球暴發的新型流感病毒[9]。甲型流感病毒可感染宿主肺部的免疫細胞，例如巨噬細胞和樹突狀細胞，分泌一系列促炎細胞因子和趨化因子[10]，造成細胞因子風暴，其感染還能使得免疫細胞大量向肺部浸潤，從而導致急性肺組織損傷引發急性呼吸窘迫綜合征，且發病過程常常伴隨細菌感染，嚴重危害宿主的生命安全[11]。甲型流感病毒具有突變能力強，傳播速度快，對宿主的生命安全造成威脅等特點，所以對于此病毒的防治極其重要。

2 NLRP3炎性小體及其激活機制

NOD樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs)是一種胞內模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，它可以識別多種病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)和損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)[12]。NLRP3是NOD樣受體家族中重要的一員，其炎性小體復合物由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和半胱天冬酶-1前體(pro-cysteinyl aspartate specific proteinase-1，pro-caspase-1)組成。NLRP3由冷誘導自身炎癥綜合征基因1(cold induced autoinflammatory syndrome 1，CIAS1)所編碼，包含一個N末端的吡啶結構域(pyrin domain，PYD)、一個中央核苷酸結合寡聚結構域(nucleoside triphosphatase domain，NACTH domain)和一個C末端富含亮氨酸的重復序列(leucine-rich repeat，LRR)[13]。NLRP3感應到危險信號時，通過LRR使得其N末端的吡啶結構域PYD與ASC的PYD相互作用并結合，之后ASC通過自身的募集結構域(caspase activation and recruitment domain，CARD)來募集同樣具有CARD的pro-caspase-1，從而聚集成NLRP3炎性小體[14]。激活的炎性小體可促使ASC將pro-caspase-1切割成具有活性的caspase-1，導致促炎細胞因子白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和白介素18(interleukin-18，IL-18)的成熟與分泌，并誘導細胞死亡[15-16]。甲型流感病毒感染時會激活NLRP3炎性小體，這是宿主自身的一種先天防御手段，以執行抗病毒作用。然而，在嚴重感染患者中觀察到，NLRP3炎性小體被過度激活，并造成大量的促炎細胞因子表達，進而引發細胞因子風暴造成肺組織損傷[11]，這也是甲型流感病毒感染造成宿主死亡的主要原因。

在甲型流感病毒感染期間，NLRP3炎性小體由兩種危險信號來激活。第一危險信號為：Toll樣受體3(Toll-like receptor 3，TLR3)、Toll樣受體7(Toll-like receptor 7，TLR7)和維甲酸誘導基因I(retinoic acid-inducible gene-I，RIG-I)，識別病毒RNA，Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)可識別由于甲型流感病毒感染而表達量增加的高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein box-1，HMGB1)、然后激活核轉錄因子(nuclear factor-κB，NF-κB)，促使NLRP3、pro-caspase-1、ASC蛋白、pro-IL-1β和pro-IL-18的表達上調[17-18]。第二危險信號為：病毒引發的鉀離子外流，溶酶體成熟和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生，并促使NLRP3炎性小體的組裝[19]。在甲型流感病毒的研究中觀察到，其ssRNA、M2蛋白以及PB1-F2蛋白可激活NLRP3炎性小體[20-24]，而NS1蛋白能夠抑制NLRP3炎性小體的第一危險信號和第二危險信號，從而抑制NLRP3炎性小體的形成[25-27]。為了更直觀地看出IAV是如何影響NLRP3炎性小體的激活的，筆者做圖以清晰明示(圖1)。由于流感病毒對NLRP3的活化發揮著雙重作用，因此闡明流感病毒感染對NLRP3活化過程的影響十分關鍵。下面將闡述流感病毒自身的ssRNA或蛋白以及病毒感染時激活的信號通路對NLRP3炎性小體活化的影響。

圖1 甲型流感病毒調控NLRP3炎性小體的機制

3 甲型流感病毒自身因素對NLRP3炎性小體的影響

3.1 甲型流感病毒ssRNA和M2蛋白對NLRP3炎性小體的激活作用

甲型流感病毒自身存在的一些因素，可以刺激NLRP3炎性小體的激活，從而促進IL-1β和IL-18的成熟和分泌。報道顯示，使用甲型流感病毒PR8的ssRNA處理小鼠和小鼠骨髓來源樹突狀細胞(bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs)，皆可引起caspase-1依賴性的IL-1β分泌[20]。在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激提供第一危險信號的條件下，利用慢病毒包裝的方式，在BMDC中表達離子通道蛋白M2，觀察到IL-1β以及IL-18的分泌增加，證明甲型流感病毒M2蛋白可以通過激活第二危險信號來激活NLRP3炎性小體[21]，進一步通過引入M2突變體或使用金剛烷胺(amantadine)[22]處理來阻斷M2蛋白，能有效抑制IL-1β的成熟和分泌。以上說明甲型流感病毒中的ssRNA和M2蛋白是激活NLRP3炎性小體的重要因素。

3.2 甲型流感病毒PB1-F2蛋白對NLRP3炎性小體的調控作用

甲型流感病毒中的PB1-F2蛋白常以單體、低聚物或纖維的形式存在，感染細胞后主要定位在線粒體中，可以誘導宿主細胞線粒體途徑的細胞凋亡[24]。PB1-F2纖維形式的形成取決于其C端區域是否能夠表達全長，這也是高致病性甲型流感病毒的特征之一[28]。在骨髓來源巨噬細胞(bone marrow-derived macrophages，BMMs)中處理LPS，并表達甲型流感病毒PR8(A/PuertoRico/8/34(H1N1))的PB1-F2 C端序列寡肽，能夠引發IL-1β的成熟和分泌，未使用LPS刺激的BMM中則沒有出現IL-1β的分泌，進一步對caspase-1、ASC和NLRP3基因敲除的3種不同的BMM做相同處理，均沒有誘導IL-1β的分泌[23]，說明在高致病性甲型流感病毒感染過程中，其纖維形式的PB1-F2蛋白，能夠提供NLRP3炎性小體第二危險信號。有意思的是，在細胞內表達高致病性H7N9的PB1-F2蛋白，可以通過抑制線粒體抗病毒信號蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS)與NLRP3蛋白之間的相互作用，抑制NLRP3炎性小體的形成[29]。

3.3 甲型流感病毒的NS1蛋白對NLRP3的抑制作用

非結構蛋白NS1不僅能抑制干擾素(interferons，IFNs)的抗病毒作用，還能抑制NLRP3炎性小體的活性和IL-1β的分泌。通過研究NS1蛋白及其突變體在體外表達的方式，揭示了NS1蛋白在正常人支氣管上皮細胞(normal human bronchial epithelial cells，NHBEs)和THP-1巨噬細胞中的作用。通過抑制NF-κB的激活導致第一危險信號傳導的阻斷，使NLRP3、pro-caspase-1、ASC、pro-IL-1β和pro-IL-18的mRNA表達水平降低[25-27]。此外，NS1還能通過與NLRP3蛋白相互作用，以及抑制ASC的泛素化來抑制NLRP3炎性小體的組裝[25-26]。這些結果表明，甲型流感病毒的NS1蛋白，通過參與抑制第一和第二危險信號，減少NLRP3炎性小體依賴性促炎細胞因子的分泌。

4 甲型流感病毒介導的信號通路及其分子對NLRP3炎性小體的影響

4.1 mTOR對NLRP3炎性小體的激活作用

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，由mTORC1與mTORC2兩種不同的蛋白質復合物組成，在細胞存活、增殖和代謝中起關鍵作用[30]。mTOR異常激活常發生在促炎性疾病的發病機理中，包括脂多糖誘導的急性肺損傷、敗血癥、動脈粥樣硬化和神經退行性疾病，故mTOR成為這些疾病的重要治療靶點[31]。病毒中的研究發現，甲型流感病毒pdm09(pH1N1)感染BALB/c小鼠時，能夠激活mTOR使下游NF-κB活化導致NLRP3、ASC、pro-caspase-1、pro-IL-1β和pro-IL-18的表達上調，并且mTOR激活會誘發ROS的釋放，為NLRP3炎性小體提供第二危險信號，在使用抗流感病毒藥物奧司他韋(oseltamivir)和mTOR特異性抑制劑西羅莫司(sirolimus)聯合喂食且延遲喂食BALB/c小鼠后，有效抑制了病毒介導的NLRP3炎性小體的第一和第二危險信號，降低了pH1N1的復制，且明顯地減輕了肺部炎性細胞的浸潤和肺損傷的情況[32]。以上結果確定，mTOR是甲型流感病毒感染介導激活NLRP3炎性小體的一個重要蛋白，對甲型流感病毒感染引起的肺炎具有一定的治療意義。

4.2 Galectin-3對NLRP3炎性體的激活作用

半乳凝素3(Galectin-3)屬于β-半乳糖苷結合動物凝集素家族，由約135個氨基酸的保守碳水化合物結合域構成[33]。研究顯示，在H5N1感染的小鼠肺部勻漿中，Galectin-3的mRNA和蛋白水平顯著上調，使用H5N1分別感染正常的和Galectin-3敲除的BMM，對比發現：后者在病毒感染之后IL-1β的分泌量大幅減少，ASC的低聚物水平下降；在人胚腎293T細胞(human embryonic kidney 293T cells，HEK293Ts)中過表達Galectin-3，其細胞上清液中IL-1β的分泌量增加，且通過免疫熒光檢測觀察到ASC斑點增多以及ASC與NLRP3的締合增強[34]。這些結果說明，在甲型流感病毒感染期間能夠上調Galectin-3的表達，從而促進NLRP3炎性小體的組裝和IL-1β的分泌，揭示Galectin-3在甲型流感病毒感染引發炎癥過程中的作用，為炎癥的治療提供了一些理論基礎。

4.3 IRF-1對NLRP3炎性小體的激活作用

干擾素調節因子1(interferon regulatory factor-1，IRF-1)是IRF轉錄因子家族的第一個成員，為IFN和IFN刺激基因(interferon-stimulated genes，ISGs)的調節因子，在抗病毒過程中起到作用[35]。在感染甲型流感病毒PR8的IRF1-/-骨髓衍生巨噬細胞(bone marrow derived macrophages，BMDMs)中，發現由NLRP3介導的caspase-1的活化水平與野生型(wild type，WT)組別相比有了明顯地下降，并且降低IL-1β和IL-18的成熟和分泌，使用甲型流感病毒(X31和WSN毒株)感染IRF1-/-BMDM也得到了相同的結果。此外，在感染甲型流感病毒(X31和WSN毒株)的NLRC4和AIM2缺陷細胞中，caspase-1裂解均正常發生，進一步證明了IRF-1在甲型流感病毒感染過程中，具有促進NLRP3炎性體激活的特定作用[35]。IRF-1是Z-DNA結合蛋白1(Z-DNA binding protein 1，ZBP1)的轉錄調節因子，在甲型流感病毒感染期間能夠上調ZBP1蛋白的表達，且ZBP1/DAI是流感病毒固有的傳感器，能夠在甲型流感病毒感染期間激活NLRP3炎性小體[36-37]。所以，在甲型流感病毒感染期間是通過激活IRF-1/ZBP1/NLRP3信號通路來引起炎癥反應的。

4.4 RIPK2對NLRP3炎性小體的抑制作用

受體相互作用蛋白激酶2(receptor-interacting protein kinase 2，RIPK2)是細菌感染引起炎癥反應的關鍵介質，能夠調控NF-κB以及MAPK信號通路，以激活炎癥細胞并促進促炎細胞因子和趨化因子的分泌[38]。微管相關蛋白1輕鏈3-II (microtubule-associated protein 1 light chain 3-II，LC3-II)是自噬相關蛋白，通過檢查LC3的表達水平是檢測自噬活性的一種手段。研究發現，在甲型流感病毒(PR8或X31)感染的RIPK2-/-BMDM中，其LC3-II蛋白表達量以及自噬體的計數，均遠低于WT組別的BMDM，且caspase-1的激活得到了增強，IL-18的分泌量增多，RIPK2下游的Unc-51樣自噬激活激酶1(Unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1)的磷酸化水平降低。使用ULK1-/-BMDM感染PR8，觀察到相對于WT組別，細胞中線粒體自噬水平下降且caspase-1的活性有明顯的上調[39]。這說明RIPK2在甲型流感病毒感染時對NLRP3炎性小體的激活起到負調控作用。

然而，調控NLRP3炎性小體激活的細胞因子還有許多，比如蛋白激酶R(protein kinase R，PKR)能夠通過激活NF-κB以促進NLRP3炎性小體的活化[40]；微小RNA-233(microRNA-233，miR-233)能夠通過抑制NLRP3蛋白的表達從而抑制炎性小體產生IL-1β[41]；小二聚體伴侶(small heterodimer partner，SHP)能夠與NLRP3結合并競爭性地抑制NLRP3和ASC在線粒體上的相互作用從而抑制NLRP3炎性小體的激活[42]；NLRP3炎癥小體可經干細胞因子復合體亞單位F-box和富含亮氨酸的重復蛋白2(F-box and leucine-rich repeat protein 2，FBXL2)，介導的泛素化作用后被蛋白酶體降解[43]等，但是這些細胞因子在甲型流感病毒感染宿主時，對NLRP3炎性小體激活的調控機制尚未清楚。

5 NLRP3炎性小體在甲型流感病毒感染期間的抗病毒能力

NLRP3炎性小體在抗甲型流感病毒免疫應答中扮演關鍵的角色[20,44-45]。研究發現，感染PR8的NLRP3-/-、caspase-1-/-和ASC-/-小鼠與同樣感染PR8的WT小鼠相比，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中IL-6、腫瘤壞死因子- β(tumor necrosis factor- β，TNF-β)、角質形成細胞衍生細胞因子(keratinocyte-derived cytokines，KC)和巨噬細胞炎癥蛋白2(macrophage inflamma-tory protein-2，MIP-2)等的表達量以及病毒清除率降低。在這些小鼠中，還觀察到嗜中性粒細胞和單核細胞向肺部浸潤減少、小鼠死亡率增加的現象[44]。caspase-1-/-小鼠與WT小鼠相比，在感染后顯示出更嚴重的病毒性肺炎，伴有彌漫性肺泡損傷，廣泛性上皮壞死，以及甲型流感病毒抗原在肺泡上皮中的表達增加[45]。NLRP3-/-的小鼠在感染甲型流感病毒后，有明顯的上皮壞死和氣道阻塞的現象，其中纖維蛋白和壞死的細胞碎片出現膠原蛋白的沉積[20]。這些研究表明，NLRP3炎性小體，會限制甲型流感病毒感染后的病毒復制程度，并減輕病毒性肺炎和組織損傷。

6 NLRP3炎性小體的激活對甲型流感病毒致病力的促進作用

機體在感染甲型流感病毒后能夠激活NLRP3炎性小體從而促使IL-1β和IL-18成熟和分泌，IL-1β和IL-18分別與多種細胞類型上表達的細胞表面受體IL-1R和IL-18R相結合，以激活NF-kB，轉錄出炎癥因子從而誘導炎癥反應[46]，這是機體對抗病毒的一種先天性免疫反應。NLRP3炎性小體的激活能夠募集免疫細胞和促炎細胞因子以對抗病毒入侵，然而持續升高的促炎細胞因子濃度能夠造成細胞因子風暴，表現為 IL-1β、IL-18、IL-6、IL-17、TNF-α、IFN-γ、干擾素誘導蛋白10(IFN-γ-inducible protein-10，IP-10)和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)等細胞因子的異常高表達[47]，以加劇甲型流感病毒誘發肺部損傷的程度。高濃度IL-1β的分泌可以減少細胞上皮鈉離子通道，導致肺水腫，并且與急性呼吸窘迫綜合征的發生有關[48]，這是嚴重的甲型流感病毒感染患者的臨床特征。IL-18能夠誘導T細胞和自然殺傷細胞(natural killer cells，NKs)產生IFN-γ，以及促炎細胞因子引起炎癥反應[49]。因此，肺和血清中高濃度的IL-1β和IL-18，與高致病力的甲型流感病毒感染引起強烈的炎癥反應有關。

7 治療甲型流感病毒引發NLRP3依賴性炎癥的研究

MCC950是一種針對NLRP3的特異性抑制劑，能夠阻止NLRP3炎性小體依賴性caspase-1活化引起的IL-1β和IL-18的成熟和分泌。Coates等[50]研究發現，使用MCC950處理甲型流感病毒A/WSN/33(H1N1)毒株感染的THP-1巨噬細胞，對其細胞上清液進行了ELISA分析。結果顯示，caspase-1和IL-1β活化水平受到了明顯的抑制，在感染甲型流感病毒WSN毒株后接受MCC950治療的小鼠，體重減輕的情況得到改善，存活率高于未接受治療的小鼠，且小鼠肺部caspase-1和IL-1β的活化有明顯的下調，說明MCC950可以抑制甲型流感病毒感染引起的NLRP3依賴性炎癥反應。巨噬細胞是甲型流感病毒感染期間NLRP3炎性小體激活因子的主要來源，使用MCC950處理被甲型流感病毒WSN毒株感染的肺泡巨噬細胞(alveolar macrophages，AMs)能夠抑制NLRP3炎性小體的激活，在小鼠攻毒試驗中發現，MCC950不會影響WSN感染時I型干擾素的產生和病毒的清除率[50]。因此，MCC950可做為標靶藥物治療甲型流感病毒感染引發的炎癥反應。

8 結語與展望

甲型流感病毒是一種危害人類與動物健康安全，且具有極高傳播速度的危險病毒，病毒感染宿主時會激活NLRP3炎性小體，促使IL-1β和IL-18成熟和分泌，引起炎癥反應，這是宿主的先天抗病毒手段。過度激活的NLRP3炎性小體會對肺部造成嚴重損傷，這也是甲型流感病毒感染導致宿主死亡的主要原因。研究發現，甲型流感病毒的ssRNA、M2蛋白以及纖維形式的PB1-F2蛋白均能夠促進NLRP3炎性小體的激活，NS1蛋白和H7N9的PB1-F2蛋白能夠抑制NLRP3炎性小體激活。在病毒感染時，能夠通過激活mTOR，以及上調Galectin-3、IRF-1和RIPK2的表達來調控炎癥反應。近年來發現，NLRP3特異性抑制劑MCC950，對甲型流感病毒感染造成的NLRP3依賴性炎癥，在小鼠中具有一定的治療效果。雖然甲型流感病毒感染調控NLRP3炎性小體的機制研究已經取得了較為理想的突破，但是仍然有一系列的問題需要去探索，如NLRP3炎性小體活化機制的進一步研究，在甲型流感病毒感染時，如何通過把控對NLRP3炎性小體激活的正調控和負調控因素，來治療因炎性小體過度活化而導致的肺部炎癥和病理損傷等。本文通過描述甲型流感病毒感染如何調控NLRP3炎性小體的活化機制，為治療甲型流感病毒引起的炎癥反應提供了具有潛力的策略。