豬圓環病毒1型LAMP檢測方法的建立及初步應用

田瑤，李佳昕，楊瑩，王碩，時建立，彭喆，李琛，徐紹建，吳曉燕，劉暢，韓紅，李俊，3

（1.青島農業大學動物醫學院，山東 青島 266109；2.山東省農業科學院畜牧獸醫研究所，山東 濟南 250100；3.山東師范大學生命科學院，山東 濟南 250014）

豬圓環病毒（PCV）最初被認為是豬腎連續細胞系中的一種類似于微小病毒的病毒污染劑。隨后，Allan等［1］證實該病毒來源于制備PK-15細胞的豬腎組織，是一種無包膜、小（17 nm）病毒，含有單鏈環狀DNA基因組。在群體水平上，PCV1的血清流行率在10%到100%之間［2］。雖然PCV1對豬沒有明顯的致病性，但是PCV1和PCV2具有76%以上的核苷酸同源性，并且兩種病毒在豬群中臨床感染率均比較高，存在共同感染的現象，所以不能忽視PCV1的潛在致病性［3］。據報道，體外感染PCV1能夠對豬肺泡巨噬細胞功能產生短暫影響［4］。經PCV1感染后部分仔豬的肺臟、腸道與淋巴器官等組織中能夠檢測出相應的抗原［5］。因此，目前仍難以排除PCV1對豬免疫系統的潛在損害作用。

LAMP是在2000年由日本的Notomi等［6］發明的一種能夠在恒溫條件下快速擴增核酸片段的技術。特異性核苷酸延伸是通過具有鏈置換活性的DNA聚合酶和兩對內外引物實現的。保持恒定溫度60～65℃在30～60 min內即可完成反應［7，8］。與其他方法相比，LAMP具有快速、特異、經濟等優點［7-11］。SYBR GreenⅠ是一種可以結合在雙鏈DNA雙螺旋小溝區域的染料，游離狀態時SYBR GreenⅠ可發出微弱熒光，肉眼觀察呈橙色；與雙鏈DNA結合后，熒光增強，紫外分析儀下呈綠色［12］。因此，SYBR GreenⅠ也被用于LAMP產物的檢測［13］。

豬圓環病毒之間及其與豬瘟病毒、豬藍耳病病毒之間存在共感染現象。PCV1可在肺組織中高效復制并產生病理學改變，因此建立一種PCV1的快速檢測方法是必要的。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株與試劑

豬圓環病毒1型（PCV1）、豬圓環病毒2型（PCV2）、豬圓環病毒3型（PCV3）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬細小病毒（PPV）均由山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室保存。103份病料組織來自山東省規?；i場。2×Lamp Master Mix購自生工生物工程（上海）股份有限公司；DL2000 DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；2×EasyTaq?PCR SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司。Biospin病毒DNA提取試劑盒購自杭州博日科技股份有限公司；質粒小提試劑盒購自Axygen。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 根據NCBI中GeneBank公布的PCV1基因序列（GenBank登錄號：AY193712.1），利用在線設計軟件Primer Explorer V 4.0（http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）設計LAMP引物。利用Primer 5.0設計普通PCR引物。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 DNA的提取及PCR擴增 采用Biospin病毒DNA提取試劑盒提取DNA并進行普通PCR擴增。反應體系（20.0μL）：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，SuperMix 10.0μL，DNA模板0.5 μL，ddH2O 8.5μL。反應條件：95℃3 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，30個循環；72℃7 min。反應結束取5μL擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.3 LAMP檢測方法的建立 LAMP反應體系（25.0μL）：2×Lamp Master Mix 12.5μL，FIP（10μmol/L）2.0μL，BIP（10μmol/L）2.0μL，F3（10μmol/L）0.5μL，B3（10μmol/L）0.5μL，DNA 模 板1.0μL，DNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 6.0μL。無菌去離子水作為陰性模板。反應結束后取5μL擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.4 LAMP反應條件優化 水浴溫度控制在60℃進行反應時間優化，分別于水浴鍋中反應40、45、50、55、60、65 min，取5μL擴增產物置于1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，依據擴增效果確定最佳反應時間。選取最佳反應時間后分別將溫度控制在57、58、59、60、61、62、63、64℃條件下擴增，反應結束取5μL擴增產物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，確定最佳反應溫度。

1.2.5 LAMP特異性和敏感性試驗 分別以PPV、PRV、PCV2、PCV3為模板，同時設陰性對照。在優化條件下進行LAMP反應，擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行特異性檢測。

將PCV1陽性質粒10倍倍比稀釋（初始濃度為200 ng/μL）進行PCR及LAMP敏感性方法檢測。

1.2.6 臨床樣品檢測 取103份疑似患病豬組織分別進行LAMP和普通PCR檢測，比較兩種方法的檢出率，評估建立的LAMP方法在臨床檢測上的適用性。

2 結果與分析

2.1 引物篩選

本研究設計了多組LAMP引物以及PCR引物，對各組引物擴增條帶清晰度和整齊度進行比較，從而篩選出LAMP最佳引物組（表1）。PCR引物為F3、B3。PCR以及LAMP擴增條帶大小均為190 bp左右。圖1為篩選出的LAMP引物所在位置。

表1 引物序列和位置

圖1 LAMP引物位置

2.2 LAMP反應條件優化

根據瓊脂糖凝膠電泳結果中條帶的清晰度以及整齊度，確定最佳反應時間為60 min（圖2），最佳反應溫度為62℃（圖3）。

圖2 LAMP反應時間優化

圖3 LAMP反應溫度優化

2.3 LAMP特異性

特異性試驗（圖4）及LAMP可視化結果（圖5）顯示，只有PCV1為陽性，其他均為陰性，說明該方法有很好的特異性。

圖4 LAMP反應特異性

圖5 LAMP可視化特異性試驗

2.4 LAMP敏感性試驗

敏感性試驗表明，LAMP檢測限為1×101copies/μL（圖6、圖7），普通PCR最低檢測限為1×103copies/μL（圖8）。

圖6 LAMP敏感性試驗

圖7 LAMP可視化敏感性試驗

圖8 普通PCR敏感性試驗

2.5 臨床樣品檢測試驗

對103份疑似患病豬組織分別進行LAMP和普通PCR檢測，LAMP陽性率為34.0%（35例），普通PCR陽性率為29.1%（30例）。兩種方法檢測結果一致的樣本數占總樣本數的比例即為兩者的符合率。結果表明，兩種檢驗方法的符合率為89.5%。

3 討論與結論

雖然PCV1對豬沒有致病性，但是豬場中常存在PCV1、PCV2和PCV3共感染現象，對養豬業存在潛在的危險。Krakowka等［14］對接種未感染的細胞裂解物或單一病毒接種物（PPV、PCV-1或PCV-2）的仔豬進行研究，結果顯示仔豬臨床均正常，并且接種PCV-1的仔豬淋巴結出現輕度的增生，10頭仔豬中有5頭是短暫的病毒血癥。因此，有必要建立一種快速、準確、敏感的PCV1檢測方法。目前，環介導等溫擴增技術已經和常規PCR、實時熒光定量PCR等共同成為常規檢測的主要工具［15］。但是常規PCR和熒光定量PCR均需要特定的儀器設備，價格不但昂貴而且還需專業人員操作，成本高、檢測時間長，不適用于現場快速檢測。LAMP技術突出的優勢在于不需要特定的儀器設備，只需要保持溫度在60～65℃，且1 h之內就可以完成反應，具有簡單、快速、特異性強和敏感性高等特點。在結果判定方面，已有多種肉眼可視的方法及實時熒光檢測法得到廣泛應用，可以從源頭上控制由瓊脂糖凝膠電泳造成的氣溶膠污染問題，尤其適用于現場快速檢測及床旁檢測［16］。本研究建立的LAMP檢測方法紫外分析儀下陽性結果為黃綠色，陰性結果為橘色，檢測結果直觀且容易分辨。

張福良等［17］建立的PCV1型熒光定量PCR檢測方法檢測限為1.0×104copies/μL。王立嬌等［18］建立的PCV1與PCV2型雙重PCR檢測方法中PCV1的檢測限為1.7×103copies/μL。本試驗建立的PCV1 LAMP可視化快速檢測方法檢測限為1×101copies/μL。該方法為進一步研究PCV1在豬體內的分布情況、病毒的感染機制以及PCV1在PCV2致病機制中的作用奠定了基礎，可用于PCV1的流行病學調查及其他PCV1相關研究。