苯污染對大鼠腦組織環核苷酸與相關蛋白水平的影響

李登樓, 謝明仁

苯污染對大鼠腦組織環核苷酸與相關蛋白水平的影響

李登樓1, 謝明仁2,*

1. 甘肅政法大學網絡空間安全學院, 蘭州 730070 2. 甘肅政法大學公安技術學院, 蘭州 730070

為了探索苯污染對人類健康損傷作用的因素, 選用SPF級Wistar大鼠為實驗對象, 分為4組: 低劑量組灌胃苯 0.19 g·kg-1, 中劑量組灌胃苯 0.38 g·kg-1, 高劑量組灌胃苯 0.76 g·kg-1, 對照組灌胃菜籽油2 mL·kg-1;用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測腦組織中環核苷酸和相關蛋白的水平。結果發現, 連續給予大鼠不同劑量苯21 d, 低、中、高劑量大腦皮質cAMP、c-fos、Bax和caspase-9水平比對照組分別升高了22.41%—59.53%, 38.28%—81.34%, 29.08%—63.04%和44.53%—70.07%; cGMP、Bcl-2水平比對照組分別降低了15.20%—49.79% 和13.42%—46.98%。丘腦組織cAMP、c-fos、Bax和caspase-9水平比對照組分別升高了34.71%—63.34%, 28.32%—78.04%, 16.54%—49.46% 和9.10%—61.57%; cGMP、Bcl-2水平比對照組分別降低了20.00%—33.83% 和8.53%—39.53%。結果提示, 苯污染引起腦組織損傷和細胞凋亡主要與cAMP、c-fos、Bax、caspase-9水平升高及cGMP和Bcl-2水平降低有關。

苯污染; 腦組織; 環核苷酸; Wistar大鼠

0 前言

苯及苯系物(甲苯、苯酚、氯苯、二甲苯等)不僅嚴重污染人類及其他生物賴以生存的自然生態環境[1], 而且直接危害陸生動物[2]、水生動物[3]和人類的健康[4]。苯污染引起急性中毒[5], 造成神經系統[6]、造血系統[7]、生殖系統[8]嚴重危害, 出現頭暈、頭痛、咳嗽[9]和惡心等癥狀[10], 導致DNA損傷從而引起遺傳毒性作用[11]。近年來隨著分子生物學研究的進一步發展, 對c-fos、Bcl-2、bax和caspase 基因在細胞損傷、細胞凋亡信號傳導過程中作用研究的進一步深入, 發現Bcl-2、bax基因不但可作為caspase基因的上游調控機制, 還參與對caspase活性的調節。鑒于苯污染的社會普遍性和對人類健康嚴重的危害性, 在提倡綠色生活、低碳環境的同時, 加強預防保護措施更為必要。本文為了探索苯污染與Bcl-2、c-fos、bax和caspase基因表達產物在組織器官和細胞損傷方面的關系, 用大鼠進行實驗研究, 為苯的合理應用, 研究預防苯污染中毒損傷機制和環境治理提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物, SPF級Wistar雄性大鼠, 體重 180—190 g, 購于甘肅中醫藥大學科研實驗中心[SCXK (甘)2015-0001]。全部實驗均在甘肅省證據科學技術研究與應用重點實驗室 SPF 級動物實驗室完成, 實驗動物使用許可證號: SYXK (甘)2015- 0006。苯: 分析純 A.R, 天津市東麗區天大化學試劑廠生產,實驗時用菜籽油稀釋成所需濃度; 金龍魚菜籽油: 陜西省咸陽市興平食品工業園生產; c-fos、Bcl-2、Bax、cAMP、cGMP和caspase-9試劑盒: 上海酶聯生物科技有限公司; 酶標儀: Thermo Scientific MK3 型酶標儀, 賽默飛世爾(上海)儀器有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和給藥

將40只Wistar大鼠隨機分為4組, 每組10只。按苯對大鼠半數致死量(LD503.80 g·kg-1)的 1/5、1/10、1/20 給藥量進行分組, 每組10只大鼠。低、中、高劑量組分別灌胃給于苯0.19、0.38和0.76 g·kg-1; 對照組灌胃給予菜籽油2 mL·kg-1。每天稱重, 按重量給藥, 觀察動物活動狀態, 連續給藥21 d。

1.2.2 動物腦組織采集、檢測

末次給藥后次日, 全部動物用乙醚吸入麻醉, 無痛打開顱腔, 解剖出全腦,切取右側大腦皮質和丘腦, 按試劑盒說明檢測cAMP、cGMP、c-fos、Bax、Bcl-2和caspase-9水平。

1.2.3 直線回歸方程制作

以試劑盒標準品的濃度為橫坐標, 吸光度(OD)為縱坐標作出標準曲線的直線回歸方程。

1.2.4 統計學處理

實驗數據采用 SPSS 22.0 軟件進行統計學處理。計數資料用百分率(%)表示, 組間比較用單因素方差分析,以<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 動物的一般狀況

給藥第7天后, 動物出現活動遲緩, 體重減輕, 體毛失去光澤、倒豎; 對照組動物未出現上述癥狀。

2.2 苯污染對大鼠大腦皮質環核苷酸水平的影響

cAMP標準曲線的直線回歸方程為:=3.9×10-3+9.6×10-3,2=0.9996。將動物大腦皮質 OD 值代入直線回歸方程, 測得低(965.02±0.55)、中(990.01±0.18)、高(1192.50±1.13)劑量組cAMP水平比對照組(747.5±0.86)分別升高了 29.09%、32.44%、59.53% (=762.2,0.01)。見圖1。

cGMP標準曲線的直線回歸方程為:=2.0×10-4+5.5×10-3,2=0.999。將動物大腦皮質 OD 值代入直線回歸方程, 測得低(63.71±0.05)、中(60.64±0.07)、高(46.15±0.04)劑量組大鼠大腦皮質中cGMP水平比對照組(91.92±0.02)分別降低了30.70%、34.03%、49.79%(=200.2,0.01)。見圖1。

2.3 苯污染對大鼠大腦皮質相關蛋白水平的影響

c-fos標準曲線的直線回歸方程為:=1.0×10-2+1.01×10-2,2=0.999。將動物大腦皮質 OD值代入直線回歸方程, 測得低(14.45±0.04)、中(15.95±0.11)、高(18.95±0.10)劑量組c-fos水平比對照組(10.45±0.05)分別升高了 38.28%、52.63%、81.34%(=612.8,0.01)。見圖2。

圖1 苯污染對大鼠大腦皮質環核苷酸水平的影響(與對照組比: **P<0.01)

Figure 1 Effect of benzene pollution on cyclic nucleotides levels in cerebral cortex of rats(**0.01control group)

Bcl-2標準曲線的直線回歸方程為:=5.0×10-4+2.2×10-3,2=0.9995。將動物大腦皮質 OD 值代入直線回歸方程, 測得低(211.02.00±0.14)、中(196.02.00±0.19)、高(158.02±0.06)劑量組Bcl-2水平比對照組(298.02±0.49)分別降低了 29.19%、34.23%、46.98%(=236.3,0.01)。見圖2。

Bax標準曲線的直線回歸方程為:=2.17×10-1+2.12×10-1,2=0.9997。將動物大腦皮質 OD 值代入直線回歸方程, 測得低(128.01±0.05)、中(136.78±0.33)、高(161.69±0.32)劑量組Bax水平比對照組(99.17±0.11)分別升高了 29.08%、37.92%、63.04%(=333.6,0.01)。見圖2。

caspase-9標準曲線的直線回歸方程為:=1.5×10-3+2.19×10-2,2=0.9996。將動物大腦皮質 OD 值代入直線回歸方程, 測得低(113.67±0.02)、中(133.66±0.24)、高(153.66±0.24)劑量組caspase-9水平比對照組(90.35±0.14)分別升高了 44.53%、47.94%、70.07%(=297.4,0.01)。見圖2。

2.4 苯污染對大鼠丘腦組織環核苷酸水平的影響

將各組大鼠丘腦組織測定的OD值代入直線回歸方程, 測得低(155.21±0.41)、中(172.23±0.20)、高(188.32±0.33)劑量組cAMP 水平比對照組(115.31±0.31)分別升高了 34.71%、49.46%、63.34%(=596.3,0.01); 低(66.08±0.07)、中(64.12±0.12)、高(66.08±0.18)組cGMP 水平比對照組(91.85±0.13)分別降低了 28.06%、30.19%、36.07%(=842.2,0.01)。見圖3。

圖2 苯污染對大鼠大腦皮質相關蛋白水平的影響(與對照組比: **P<0.01)

Figure 2 Effect of benzene pollution onrelated proteins levels in cerebral cortex of rats(**0.01control group)

2.5 苯污染對大鼠丘腦組織相關蛋白水平的影響

將各組大鼠丘腦組織測定的OD值代入直線回歸方程, 測得低(29.45±0.09)、中(33.92±0.12)、高(40.86±0.20)劑量組c-fos水平比對照組(22.95±0.11)分別升高了 28.32%、49.76%、78.04%(=403.23,0.01); 低(182.02±0.09)、中(174.01±0.04)、高(156.01±0.07)劑量組Bcl-2水平比對照組(258.03±0.07)分別降低了29.46%、32.56%、39.53%(=305.4,0.01); 低(215.15±0.09)、中(228.07±0.28)、高(250.29±0.47)劑量組Bax水平比對照組(167.46±0.37)分別升高了28.48%、36.19%、49.46%(=745.99,0.01); 低(198.02±0.12)、中(207.01±0.05)、高(253.67±0.24)劑量組caspase-9水平比對照組(157.02±0.13)分別升高了 26.11%、31.84%、61.57%(=472.4,0.01)。見圖4。

3 討論

研究結果表明, 外界環境因素對生物組織器官的損傷受體內多種基因的參與和調控。c-fos基因是一種存在于正常神經元細胞核內的即刻早期應激基因,當機體受到環境刺激后,即刻引起c-fos蛋白的表達,其表達產物c-fos蛋白作為一類核蛋白轉錄因子, 與靶基因特異序列結合,導致組織細胞內生化反應的改變, 起到了第三信使[12]的作用。在調控細胞生長、分裂、增殖、分化乃至程序性死亡(凋亡)等方面發揮信使作用, c-fos表達可作為神經元接受傷害性刺激激活的標志。在一定程度上c-fos表達水平與所受刺激強度成正比。c-fos的表達影響了許多生命活動和過程,引起了人們的廣泛關注[13]。尹柏雙等在作動物麻醉實驗時發現, 麻醉劑使大鼠大腦皮質內c-fos蛋白顯著增加[14]。杜艷[15]采用艾灸方法刺激小鼠, 小鼠大腦皮層、海馬組織c-fos蛋白的表達明顯升高。童民鋒等分別損傷大鼠顱腦后6 h和24 h, 大鼠腦外傷組損傷灶周圍腦組織中c-fos蛋白表達明顯增高[16]。Bax、Bcl-2共屬于Bcl-2基因家族。Bcl-2是細胞凋亡抑制基因, Bax不僅拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用, 而且具有促進細胞凋亡的功能。Bcl-2、bax表達蛋白位于線粒體上游, 是線粒體膜通透性改變的重要調控因素, 其過度表達能控制cyt-c的釋放和下游caspase表達蛋白酶的活化, 介導組織器官的損傷和細胞的死亡。Bax和Bcl-2形成多聚體, 使細胞線粒體的通透性增強, 細胞色素c( cyt-c)等穿過線粒體膜, 進入細胞質, 與Caspase-9 結合加速細胞凋亡。李偉等[17]用對比劑建立腎病大鼠模型發現, 模型組大鼠出現廣泛腎小管上皮細胞空泡樣變性, 部分腎小管壞死; 腎間質纖維化, 腎細胞凋亡指數、Bax蛋白相對表達量顯著高于對照組; Bcl-2蛋白相對表達量顯著低于對照組。李攀登[18]用不同濃度的氫醌分別處理U937細胞24 h和48 h后, 細胞體積增大,胞漿中有空泡,胞核發生畸形, U937細胞的增殖抑制率、細胞凋亡率隨氫醌作用時間及濃度的增加而增加,呈時間-劑量依賴性; 細胞Bax蛋白表達量增加, Bcl-2蛋白表達量減少, 細胞Caspase-3蛋白的表達量增加, 其機制與調控凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3的表達有關。楊雙波[19]給予昆明種雄性小鼠100、400mg·kg-1苯35 d后處死, 小鼠睪丸組織結構損傷, 染毒濃度越高,病理損害越明顯; 睪丸細胞Bcl-2下調, Bax表達上調,睪丸細胞凋亡率高于對照組, 并有量-效關系。于光艷[20]給于小鼠400、800和1600 mg·M-3氣態苯連續染毒15 d, 小鼠骨髓邊緣及中央處細胞數明顯減少, 細胞凋亡率明顯高于對照組, Bax、Cytc、Caspases-9、Caspases-3陽性細胞數隨染毒劑量的增加而顯著升高, 而Bcl-2陽性細胞數則明顯低于對照組。研究發現[21], cAMP 是生物體內一種重要的調控信號分子, 是細胞內傳遞信息的第二信使。cAMP和cGMP 是相互拮抗的物質, 在正常生理狀態下, 二者比值保持相對恒定, 否則可引起新陳代謝的紊亂, 導致機體損傷或病變[22]。實驗結果發現, 連續給予Wistar大鼠苯0.19、0.38、0.76 g·kg-121 d, 大鼠大腦皮質和丘腦組織中cAMP水平、c-fos、Bax 和caspase-9蛋白水平隨給藥濃度的增加而顯著升高, cGMP、Bcl-2水平隨給藥濃度的增加明顯降低。實驗結果與上述學者研究結果一致。實驗結果提示, cAMP和c-fos、Bax、caspase-9蛋白具有促進細胞凋亡的作用, 是引起組織細胞損傷的主要因素, 凡能引起它們水平升高的體內外環境因素, 均可導致細胞凋亡和組織器官損傷; cGMP和Bcl-2具有抑制細胞凋亡的作用。實驗結果表明, 苯污染使大鼠腦組織中cAMP、c-fos、Bax、caspase-9水平升高, cGMP、Bcl-2水平降低, 從而導致腦組織損傷和細胞凋亡。而c-fos、Bax、Bcl-2、caspase-9蛋白表達和cAMP、cGMP環核苷酸之間的相互聯系和調節作用有待進一步探索。

圖3 苯污染對大鼠丘腦組織環核苷酸水平的影響(與對照組比: **P<0.01)

Figure 3 Effect of benzene pollution oncyclic nucleotides levels in thalamus tissue of rats(**0.01control group)

圖4 苯污染對大鼠丘腦組織相關蛋白水平的影響(與對照組比: **P<0.01)

Figure 4 Effect of benzene pollution on related proteins levels in thalamus tissue of rats(**0.01control group)

[1] SVECOVA V, TOPINKA J, SOLANSKY I. Personal exposure to volatile organic compounds in the Czech Republic[J]. Journal of Exposure Science and Environ-mental Epidemiology, 2012, 22: 455–460.

[2] 劉秋英, 梁曉陽, 王秀芹, 等. 短期苯染毒對大鼠中樞神經系統及血液指標的影響[J]. 南方醫科大學學報, 2011, 31(11): 1935–1937.

[3] 邢軍. 苯、氯苯、苯酚、4-氯酚對斑馬魚、孔雀魚、劍尾魚的急性毒性[J]. 生態環境學報, 2011, 20(11): 1720–1724.

[4] WANG Zhonghua, XU Xiaoyu, HE Bingshu. The impact of chronic environmental metal and benzene exposure on human urinary metabolome among Chinese children and the elderly population[J]. Ecotoxicology and Environ-mental Safety, 2019, 169: 232–239.

[5] 劉旻江, 嘉欣, 陳嘉斌. 低水平職業性苯接觸人群健康損害及基因多態性影響研究進展[J]. 中國職業醫學, 2018, 45(4): 511–516.

[6] RAFATI A. , ERFANIZADEH M. , NOORAFSHAN A. Effect of benzene on the cerebellar structure and behavioral characteristics in rats[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 2015, 5(7): 568–573.

[7] 沙焱, 李智民. 苯所致白血病機制研究進展[J]. 職業衛生與應急救援, 2013, 31(3): 122–125.

[8] 鄒麗君, 高艷芳, 賀印旎, 等. 低濃度苯和甲醛經呼吸道聯合染毒對小鼠雌性生殖毒性的影響[J]. 右江民族醫學院學報, 2020, 42(1): 11–16.

[9] ALVES L, VIEIRA D, NUNES L, et al. Relationship between symptoms, use of PPE and habits related to occupational exposure to BTEX compounds in workers of gas stations in bahia, brazil[J]. Journal of Environmental Protection, 2017, 8(5): 650–661.

[10] 俞發榮, 李登樓, 謝明仁. 苯污染對人類健康影響研究進展[J]. 生態科學2016, 35(2): 195–199.

[11] LUCIE AF, AVOGBE PH, BENJAMIN F, et al. DNA-adducts in subjects exposed to urban air pollution by benzene and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in cotonou, benin[J]. Environmental Toxicology, 2011, 26(1): 93–102.

[12] 張靜. 轉錄因子Fos蛋白家族在藥物成癮中的作用[J]. 中國藥物濫用防治雜志, 2016, 22(3): 180–182.

[13] 涂冬萍, 馬小軍, 莫長明, 等. FOS蛋白的研究進展及生物信息學分析[J]. 湖北農業科學, 2015, 54(7): 1537– 1542.

[14] 尹柏雙, 王秋竹, 付連軍, 等. c-fos基因功能及與麻醉關系的研究進展[J]. 中國獸醫雜志, 2014, 50(10): 59–61.

[15] 杜艷, 趙利華, 吳海標, 等. 艾炷灸對D-半乳糖衰老小鼠學習記憶能力和大腦皮質、海馬區c-fos蛋白表達的影響[J]. 時珍國醫國藥, 2011, 22(1): 46–48.

[16] 童民鋒, 劉偉國. c-fos基因在大鼠創傷性顱腦損傷中不同階段表達水平與細胞凋亡關系的研究[J]. 浙江創傷外科, 2009, 14(5): 432–433.

[17] 李偉, 于芬芬, 季文萱, 等. 對比劑腎病大鼠腎臟bax及bcl-2表達及羥苯磺酸鈣干預研究[J]. 中國醫藥導報, 2019, 36(32): 9–13.

[18] 李攀登, 王永紅, 肖蕓, 等. 氫醌對人白血病細胞凋亡及相關蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3表達的影響[J]. 現代預防醫學, 2018, 45(5): 878–882.

[19] 楊雙波, 李純穎, 張英彪, 等. 苯與甲醛對小鼠睪丸細胞凋亡及Bcl-2和Bax表達的影響[J]. 實用預防醫學, 2008, 27(4): 1319–1321.

[20] 宋祥福, 趙淑華, 劉曉梅, 等. 苯通過激活線粒體凋亡通路對小鼠骨髓細胞凋亡的誘導作用及其機制[J]. 吉林大學學報(醫學版), 2014, 40(5): 943–946.

[21] 俞發榮, 楊博, 李登樓, 等. 苯污染對小鼠血核苷酸水平的影響[J]. 生態科學, 2016, 35(6): 159–163.

[22] 俞發榮, 楊博, 李登樓, 等. 苯污染對大鼠肝腎功能及血核苷酸水平的影響[J]. 中國實驗動物學報, 2016, 24(6): 654–658.

Effects of benzene pollution on the levels of cyclic nucleotides and related proteins in rat brain tissue

LI Denglou1, XIE Mingren2,*

1. School of Cyberspace Security, Gansu University of Political Science and Law, Lanzhou 730070, China 2. School of Public Security Technology, Gansu University of Political Science and Law, Lanzhou 730070, China

In order to study the factors of benzene pollution on human health, SPF Wistar rats were selected as experimental materials and divided into four groups: the low-dose group was treated with benzene 0.19 g·kg-1; the medium-dose group was treated with benzene 0.38 g·kg-1; the high-dose group was treated with benzene 0.76 g·kg-1; and the control group was treated with canola oil 2 mL·kg-1. The levels of cyclic nucleotides and related proteins in brain tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The results showed that the levels of cAMP, c-fos, Bax and caspase-9 in the cerebral cortex of the rats were increased by 22.41%-59.53%, 38.28%-81.34%, 29.08%-63.04% and 44.53%-70.07%, respectively, when the rats were treated with different doses of benzene for 21 days. cGMP and Bcl-2 levels were reduced by 15.20%-49.79% and 13.42%-46.98%, respectively, compared with the control group. The levels of cAMP, c-fos, Bax and caspase-9 in thalamic tissues were increased by 34.71%-63.34%, 28.32%-78.04%, 16.54%-49.46% and 9.10%-61.57%, respectively, compared with the control group. The levels of cGMP and Bcl-2 decreased by 20.00%-33.83% and 8.53%-39.53%, respectively, compared with the control group. The results indicated that the brain tissue damage and cell apoptosis caused by benzene pollution were mainly related to the increased levels of cAMP, c-fos, Bax, caspase-9 and the decreased levels of cGMP and Bcl-2.

benzene pollution; brain tissue;cyclic nucleotides; Wistar rats

10.14108/j.cnki.1008-8873.2021.02.014

S592

A

1008-8873(2021)02-110-06

2020-03-30;

2020-04-20

蘭州市科技計劃項目(2018-1-17); 甘肅省青年科技基金項目(18JR3RA192); 甘肅政法學院青年項目(2017XQNLW13); 甘肅省司法鑒定中心項目(jdzxyb2018-10); 甘肅省高校科技創新團隊項目(2016C-09)

李登樓(1989—), 女, 甘肅靜寧人, 碩士, 實習研究員, 主要從事法醫毒理學教學和研究, E-mail: tim9898@163.com

謝明仁, 男, 碩士, 副教授, 碩士生導師, 主要從事法醫毒理學教學和研究, E-mail: xmr6700@gsli.edu.cn

李登樓, 謝明仁. 苯污染對大鼠腦組織環核苷酸與相關蛋白水平的影響[J]. 生態科學, 2021, 40(2): 110–115.

LI Denglou, XIE Mingren. Effects of benzene pollution on the levels of cyclic nucleotides and related proteins in rat brain tissue[J]. Ecological Science, 2021, 40(2): 110–115.