醫藥院校黃芪多糖含藥血清制備的實驗研究＊

（山東中醫藥高等專科學校，山東 煙臺 264199）

一、材料與方法

1.材料

1.1 實驗動物和細胞

SPF級雌性SD大鼠，24只，體質量（180±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；人胃癌細胞株SGC7901購自上海美軒生物科技有限公司。

1.2 藥物與試劑

黃芪多糖粉（APS）（純度≥90%），購自山東中醫藥高等專科學校附屬醫院中藥房。完全RPMI-1640培養基（批號：KGM31800S-500）購自江蘇凱基生物技術有限公司；CCK8法細胞增殖檢測試劑盒（批號：KGA317）購自江蘇凱基生物技術有限公司。

1.3 儀器

CO2培養箱（BPN-80CW，上海一恒科學儀器有限公司）；熒光倒置顯微鏡（MF53，廣州市明美光電有限公司）；多功能酶標儀（02L3006，TECAN）；離心機（TD4A，長沙英泰儀器有限公司）。

2.實驗方法

2.1 黃芪多糖含藥血清的制備

在無菌條件下將黃芪多糖粉末溶解于PBS，制成 4mg/mL液體。取24只正常健康的雌性SD大鼠，隨機分為A、B、C三組。A、B兩組以不同的給藥途徑給藥。A組灌胃給藥，B組腹腔注射、C組灌胃給予等量生理鹽水。黃芪多糖給藥量相當于臨床黃芪注射液的等效劑量（成人用藥量250mg/d），根據藥理學實驗設計與統計分析第三版“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值”表計算，大鼠黃芪多糖給藥量應為22mg/d，而腹腔注射吸收率為80%左右，故B組大鼠腹腔注射的給藥量為7mL/Kg。A灌胃給藥量28 mL/Kg（灌胃吸收利用率為腹腔注射的35%～40% 左右）[12]三組大鼠均禁食相同時間（8～12小時），保持空腹狀態下，在同一時間進行給藥。連續給藥10天。每次給藥后8h及末次給藥后1h，清醒狀態下進行大鼠股動脈取血，連續采集10天，無菌分離血清，經56℃，35min 滅活補體后，超凈臺中用0.22μm 微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20℃保存備用。

2.2 SGC7901細胞培養

胃癌細胞SGC7901在10% 胎牛血清的RPMI1640 培養液（含青霉素、鏈霉素各 100 U/mL）中，置于37℃、5% CO2的培養箱進行常規培養。

2.3 CCK8法檢測含藥血清對SGC7901細胞生長的影響

實驗設4組，分別為A組（灌胃給藥組）、B組（腹腔注射組）、C組（空白血清組）以及Control組（陰性對照組），A、B組內再各分10個組（以血清采集日期分組），設3個復孔。取對數生長期SGC7901/ADR細胞以1×104個/孔接種于96 孔板的100μL培養液中，37℃、5%CO2條件下培養至其貼壁約70%，向完全培養基中按20%的比例分別加入黃芪多糖含藥血清、空白血清等體積空白1640培養液。孔板置于培養箱中培養48h，每孔加入10μL CCK8檢測溶液，再置于培養箱中孵育4 h，水平搖床上低速振蕩混勻，在酶標儀上于波長450nm 處讀取光密度值（OD值），比較藥物效應的發揮。

2.4 統計學分析

所有數據均采用SPSS 19.0統計軟件進行統計分析，定量資料采用平均數±標準差（X±s）表示，獨立樣本之間比較采用方差分析，以P＜0.05作為顯著性差異。

二、結果

由表1可知，A組（灌胃給藥組）當給藥到第4天，與Control組及C組相比OD值明顯降低（P＜0.05）。B組（腹腔給藥組）當給藥到第3天，與Control組及C組相比OD值明顯降低（P＜0.05）。A組內從第6天開始與第4天相比OD值有明顯差異（P＜0.05）。B組內第6天開始與第3天相比OD值有明顯差異（P＜0.05）。

表1 不同方法制備的含藥血清對SGC7901細胞增殖影響比較（OD值，X±s，n=3）

三、討論

獲取中藥含藥血清進行體外實驗，可降低中藥中非有效成分對實驗結果造成的干擾。而含藥血清制備受多種因素影響，如給藥動物選擇、給藥劑量、給藥間隔、采血時機、血清滅活及儲存等條件的不同均會造成含藥血清濃度的差異及效應的發揮。為了制備黃芪多糖含藥血清，我們選擇了兩種不同的給藥途徑，其他因素基本一致（前述給藥量的區別是為了盡量獲取一致的血藥濃度）以篩選較佳的黃芪多糖含藥血清制備的方案。通過實驗（見表），我們發現黃芪多糖含藥血清對SGC7901細胞的生長有一定的抑制作用，A、B兩組OD值比Control組和C組有降低趨勢。A組，當給藥到第4天其OD值比Control組和C組明顯降低（P＜0.05），第6天比第4天OD值明顯減低（P＜0.05），第6天到第10天的OD值無顯著差異。B組，當給藥到第3天其OD值比Control組和C組明顯降低（P＜0.05），第6天比第3天OD值明顯減低（P＜0.05），第6天到第10天的OD值無顯著差異。本實驗灌胃給藥、腹腔注射給藥，含藥血清藥效明顯發揮在分別給藥第4天和第3天，由此，說明黃芪多糖含藥血清制備是切實可行的，且腹腔給藥起效較早。A、B兩組均在給藥第6天血藥濃度有所升高基本保持穩態，說明黃芪多糖在連續給藥6天后達到穩態血藥濃度。相對于灌胃給藥，腹腔注射給藥含藥血清的OD值有下降趨勢，說明腹腔注射給藥含藥血清濃度較高，可更好保證藥效發揮。基于以上實驗結果，我們選擇腹腔注射給藥的方式制備黃芪多糖含藥血清，以保證較高的血藥濃度，同時該方法也更接近臨床給藥途徑。

在給藥動物選擇上一般選擇與人類生物特性盡量相似的動物進行實驗，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔等，本實驗選擇大鼠作為給藥動物。根據對412種藥物的半衰期、藥物達峰時間等數據的分析，若以人為測試對象，每天給藥2次，連續給藥3天，末次給藥后1h采血，80%以上的藥物，其血濃度將大于其一次給藥的最高血藥濃度[13]。我們也參考在末次給藥后1h采血制備黃芪多糖含藥血清。

綜上所述，黃芪多糖含藥血清的制備我們制定如下的實驗方案，采用健康大鼠，以臨床黃芪注射液的等效劑量作為基礎給藥量，每天在固定時間腹腔注射給藥，連續給藥7天（本實驗連續給藥6天達穩態，為了確保血藥濃度定連續給藥7天），在末次給藥后1h清醒狀態下進行大鼠股動脈取血，無菌分離血清，經56℃，35min滅活補體后，超凈臺中用0.22μm 微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20℃保存備用。