基于網絡藥理學探討桑寄生“補肝腎、強筋骨”的作用機制

李小芬 方镕澤 馮 華 王祥培*

1.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611130；2.貴州中醫藥大學藥學院，貴州 貴陽 550025；3.遵義市食品藥品檢驗所，貴州 遵義 563002

桑寄生為桑寄生科植物桑寄生Taxilluschinensis(DC.)Danser的干燥帶葉莖枝，具有祛風濕、補肝腎、強筋骨、安胎元等功效，用于風濕痹痛，腰膝酸軟、筋骨無力、崩漏經多、妊娠漏血、胎動不安、頭暈目眩等癥[1]。桑寄生始載于《神農本草經》，被列為上品，是臨床常用的祛風濕藥，而其補肝腎、強筋骨、安胎等作用在臨床上應用也非常廣泛，已經被歷代的醫家在實踐中證實[2-4]。現代研究發現，古典理論認為的“肝藏血”“腎藏精”以及“肝主筋”“腎主骨”與現代醫學研究能夠完全契合，為臨床運用“補肝腎、強筋骨”法則治療筋骨疾病提供了可靠依據[5]。腎氣旺盛，腎精充足，骨骼則健壯，骨髓生化有源，四肢百骸功能正常；肝血充盛，筋骨得到充沛的濡養，才能強健有力。因此，臨床上補肝腎、強筋骨是骨質病變的主要治法之一[6]。桑寄生主要含黃酮類、生物堿、萜類、多糖、蛋白質等化學成分，其中黃酮類成分為主要活性成分[7-9]。研究[9]發現，桑寄生水煎液可抑制骨吸收，提高骨質量，改善骨代謝的負平衡狀態，從而達到治療骨質疏松的作用。體外研究[10]表明，黃酮類物質可通過抑制破骨細胞分化，促進骨形成，起到抗骨質疏松的作用。目前，有關桑寄生“補肝腎、強筋骨”的藥效研究已有報道[9,11]，但從細胞及分子水平系統全面的揭示桑寄生以何種途徑發揮“補肝腎、強筋骨”作用的分子機制鮮見報道，亟待進一步加強。

傳統中醫藥(理、法、方、藥)由于缺乏分子生物學的表征，無法發揮其獨特的優勢，難以與現代科學有機的融合[12]。近年來，隨著網絡藥理學的興起，它主要是通過構建和整合“成分-靶標-通路-疾病”多層次網絡，分析特定信號節點之間的相互作用關系，從系統、整體角度探索藥物與機體相互作用的一門新學科[13-14]。網絡藥理學被認為是一種提高新藥臨床試驗的成功率，節省藥物研發費用的新方法，尤其有助于闡明多組分和多靶標之間潛在的復雜關系，而其整體性、系統性的特點更是與中藥“多成分、多途徑、多靶點”協同作用的特點不謀而合，為中醫藥復雜系統的研究提供了新的思路[15-16]。因此，本文采用網絡藥理學的方法，通過數據挖掘、篩選、構建桑寄生“補肝腎、強筋骨”作用的“中藥-活性成分-核心靶點-疾病”網絡，探討桑寄生“補肝腎、強筋骨”的作用機制，以期為桑寄生傳統功效作用機制的闡釋提供參考依據。技術路線如圖1所示。

1 方法

1.1 化學成分的收集 通過查閱《中華本草》、 中國知網(CNKI, http://kns.cnki.net/kns/brief/default_result.aspx)、PubMed數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、中醫藥綜合數據庫TCMID (http://www.megabionet.org/tcmid/)和中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP, http://lsp.nwu. edu.cn/tcmsp.php)，搜索桑寄生所有化學成分。

1.2 活性成分的篩選 口服生物利用度(oral bioavailability，OB) 是評估藥物能否開發的關鍵參數，也是評價中藥臨床療效的有效指標。類藥性( drug likeness，DL) 目前被廣泛用于評價先導化合物藥物是否有可能成藥的重要依據。在TCMSP 數據庫中認為 OB>30%的分子具有較好的口服生物利用度，DL>0.18的分子具有較好的類藥性[17]。將桑寄生所有化學成分，以ADME(吸收、分布、代謝、排泄)參數(OB≥30%和 DL≥0.18)或生物活性(文獻已有報道)為標準，篩選桑寄生的活性化學成分。然后通過PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索活性化學成分的結構式。

1.3 藥物靶點與疾病靶點的建立 通過TCMSP數據庫和Swiss TargetPrediction(http://www.swissta rgetprediction.ch/)數據庫，檢索桑寄生活性化合物對應的靶點，建立活性成分靶點數據集。通過人類基因和基因表型綜合數據庫(OMIM，http://www.omim.org/)和GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)以“Bone weakness”“waist and knee pain”“Liver and kidney deficiency”和“Osteoporosis”為關鍵詞檢索“補肝腎、強筋骨”相關的靶點，建立疾病靶點數據集。最后將篩選得到的所有靶點均經UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)查詢轉化成UniProt ID格式。

1.4 核心靶點的篩選及網絡的構建 將藥物靶點與疾病靶點進行取交集，存在交集中的靶點即為桑寄生“補肝腎、強筋骨”的預測靶點。將其導入String數據庫(https://string-db.org/)中構建“藥物-疾病”交集靶點PPI網絡，并采用cytoscape 3.6.1 軟件對PPI網絡進行可視化分析，以網絡中每個節點的拓撲參數“節點連接度”(Degree)、“節點介度”(Betweenness centrality)、“節點緊密度”(Closeness centrality)的中位數為卡值，選取同時滿足大于3個卡值的節點，作為桑寄生“補肝腎、強筋骨”的核心靶點；同時采用cytoscape 3.6.1 軟件構建“中藥-活性成分-核心靶點-疾病”網絡。

1.5 生物過程分析 將核心靶點輸入Cytoscape3.6.1軟件的ClueGO插件中進行基因本體(GO)生物學過程和基于京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，以P≤0. 01作為篩選標準，篩選出具有極顯著性差異的生物過程和信號通路。

1.6 構建桑寄生“補肝腎、強筋骨”作用的通路圖 運用KEGG (https://www.genome.jp/kegg/)數據庫中的KEGG Mapper功能，將核心靶點映射在相關信號通路上，揭示桑寄生多靶點、多途徑的治療作用。

2 結果

2.1 桑寄生活性成分的篩選 從《中華本草》、中國知網、PubMed數據庫、TCMSP數據庫和TCMID數據庫中得到目前桑寄生已報道的58個化學成分，根據ADME參數(OB≥30%和 DL≥0.18)或生物活性(文獻已有報道)為標準，共篩選得到8個桑寄生活性化合物，并下載其結構式，結果見表1。

表1 桑寄生活性化合物的相關參數及結構式

表1 桑寄生活性化合物的相關參數及結構式

2.2 桑寄生活性成分靶點預測 將 TCMSP、Swiss TargetPrediction數據庫檢索得到的所有靶點，刪除重復靶點，最終得到8個活性成分對應的靶點，共計358，結果見表1。在OMIM和GeneCards數據庫以“Bone weakness”“waist and knee pain”“Liver and kidney deficiency”和“Osteoporosis”為關鍵詞檢索整合得到1535個“補肝腎、強筋骨”相關的疾病靶點。最后將篩選得到的所有靶點均經UniProt數據庫查詢轉化成UniProt ID格式。

2.3 桑寄生核心靶點的篩選 將藥物靶點與疾病靶點進行取交集，得到88個交集靶點，并繪制韋恩圖，結果如圖2所示。將交集靶點輸入String數據庫(https://string-db.org/)中構建PPI網絡，并采用cytoscape 3.6.1 軟件對PPI網絡進行可視化分析，得到所有節點3個拓撲參數的中位數值分別為15(Degree)、0.0042(Betweenness centrality)、0.5119(Closeness centrality)，選取同時滿足大于3個拓撲參數中位數值的節點，作為桑寄生“補肝腎、強筋骨”的核心靶點，結果見表2；同時采用cytoscape 3.6.1 軟件構建“核心靶點”PPI網絡，結果如圖3所示。

表2 桑寄生“補肝腎、強筋骨”核心靶點的相關拓撲參數

表2 桑寄生“補肝腎、強筋骨”核心靶點的相關拓撲參數

2.4 桑寄生“補肝腎、強筋骨”核心靶點網絡構建 通過cytoscape 3.6.1 軟件分別構建“中藥-活性成分”網絡、“活性成分-靶點”網絡、“疾病-靶點”網絡，將以上網絡合并成為一個網絡，最終構建“中藥-活性成分-核心靶點-疾病”網絡，結果如圖4所示。

2.5 GO生物過程富集分析 將33個核心靶點輸入Cytoscape 3.6.1軟件的ClueGO插件中進行GO生物過程富集分析，保留P≤0.01的結果，進行可視化分析，結果如圖5所示。結果共富集得到 68個生物過程，根據Term P-value越小，Term可靠性越高的原則，列舉了排名前20的生物過程，結果如圖6所示。結果表明桑寄生“補肝腎、強筋骨”的作用主要可能是通過調控膠質細胞分化，活性氧生物合成過程，對生長激素的反應，胰島素樣生長因子受體信號通路，肽基酪氨酸自磷酸等多個生物過程而起到治療功效，體現了中藥多途徑的治療作用。

2.6 KEGG通路富集分析 將33個核心靶點輸入Cytoscape 3.6.1軟件的ClueGO插件中進行KEGG通路富集分析，保留P≤0.01的結果，進行可視化分析，構建“靶點-通路”網絡，結果如圖7所示。根據核心基因在通路中占的個數越多，信號通路越重要，列舉了排名前20的信號通路，結果見表3。結果共富集得到 59條信號通路，其中主要的信號通路包括NF-κB信號通路，長壽調節途徑，破骨細胞分化，C型凝集素受體信號通路，JAK-STAT信號通路，雌激素信號通路，催乳素信號通路，甲狀腺激素信號通路，松弛素信號通路等，提示桑寄生“補肝腎、強筋骨”的作用可能是以上多條信號通路參與的結果。

表3 桑寄生“補肝腎、強筋骨”排名前20的信號通路富集結果

表3 桑寄生“補肝腎、強筋骨”排名前20的信號通路富集結果

2.7 桑寄生“補肝腎、強筋骨”作用的通路注釋圖 將33個核心靶點輸入KEGG數據庫的KEGG Mapper功能中，標注出核心靶點在每條相關信號通路中所占的個數。結果顯示有8個靶點蛋白參與雌激素信號通路的相關調控，揭示桑寄生多靶點、多途徑的治療作用，結果如圖8所示。

3 討論

桑寄生強筋骨的作用被歷代醫家所認可，現代醫學研究認為肝臟是多種營養物質代謝的中樞，也是人體維生素、激素等代謝的場所，這就是中醫理論所說的“肝藏血”。腎臟影響維生素D的形成及控制鈣、磷等元素的代謝，這就是中醫理論所說“腎主骨生髓”的作用。中醫理論認為“肝主筋”“腎主骨”“肝腎同源”與現代醫學研究能夠完全契合，而其強筋骨作用與補肝腎作用密切相連，是補肝腎作用的體現和應用[5,18]。鄭磊等[6]從“肝主筋”“腎主骨”“肝腎同源”3個方面探討了“補肝腎、強筋骨”的作用機制，結果表明其主要與肝臟能量代謝、核酸代謝，腎臟影響維生素D的形成、激素、鈣、磷代謝等生理過程相關，為“補肝腎、強筋骨”的現代研究提供了可靠依據。

本研究預測出桑寄生主要有效成分為槲皮苷、槲皮素、沒食子酸、維生素C、萹蓄甘、β-谷甾醇等，主要為黃酮類成分。研究[19]表明，萹蓄苷、槲皮苷為桑寄生補肝腎、強筋骨功效的代表性成分。桑寄生中槲皮素可誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和新生血管生成[20]，槲皮苷具有抑制乙酰膽堿酶和蘇氨酸激酶等作用[21]。研究[22]發現桑寄生葉子中富含豐富的維生素C，維生素C具有強烈的生理活性，參與人體多種代謝，是人體必需的維生素之一，具有解毒和改善肝功能、保持肌膚潤滑、清除自由基、保護心臟及血管、抗腫瘤等作用。網絡藥理學分析結果表明，AKT1、SRC、EGFR、TNF、JUN、PTGS2、ESR1可能為桑寄生“補肝腎、強筋骨”的潛在靶點。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 ，該蛋白參與多種生物學過程，包括代謝，增殖，細胞存活，生長和血管生成等，均是通過一系列下游底物的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化來介導的。AKT激活依賴于PI3K途徑，并被認為是該途徑中的關鍵節點。烏頭湯可改善膝骨關節炎大鼠關節軟骨的形態結構，抑制關節軟骨中與炎癥相關信號轉導通路的激活，下調p38 MAPK、JNK、Ras、ERK、iNOS 蛋白含量表達，發揮保護關節軟骨，延緩膝骨關節炎病理進程作用[23]。雌激素受體(estrogen receptor，ESR1)可延長破骨細胞的存活時間、減少其凋亡，抑制破骨細胞的活性和分化，最終達到抑制破骨細胞的骨吸收，防治骨質疏松的作用[24]。

GO生物過程富集分析，表明桑寄生“補肝腎、強筋骨”作用涉及細胞增殖、代謝過程、生物合成過程、炎癥反應等生物過程，其中膠質細胞分化，活性氧生物合成過程，對生長激素的反應，胰島素樣生長因子受體信號通路，肽基酪氨酸自磷酸可能為桑寄生“補肝腎、強筋骨”作用的主要進程。KEGG通路富集分析，表明桑寄生主要是通過調控NF-κB信號通路，長壽調節途徑，破骨細胞分化，C型凝集素受體信號通路，JAK-STAT信號通路，雌激素信號通路，催乳素信號通路，甲狀腺激素信號通路，PI3K /AKT信號通路，MAPK 信號通路發揮“補肝腎、強筋骨”作用的。在PI3K /AKT 信號通路中，當AKT 及其靶基因激活時，可促進成骨細胞的分化，小鼠敲除 AKT1 和 AKT2 基因，會出現明顯的骨量減少癥狀，提示成骨細胞可能通過 PI3K /AKT信號通路促進骨形成[25]。MAPK 信號通路是調控成骨細胞生長和分化的重要途徑，研究[26]表明其主要包括ESR1通路，p38通路和JNK通路。ESR1信號通路能上調成骨細胞中Osterix mRNA的表達，抑制骨吸收，升高骨密度。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學的方法，構建“中藥-有效成分-核心靶點-疾病”“靶點-通路”網絡，發現桑寄生“補肝腎、強筋骨”的作用機制涉及多個生物過程、多條通路，體現了中藥多成分-多靶點-多途徑的作用特點。提示桑寄生“補肝腎、強筋骨” 的作用機制可能是以上靶點和信號通路共同作用的結果。但是具體的結果仍需要進一步的實驗加以證明。