石淋通顆粒HPLC指紋圖譜研究

占麗琴 馬 杰 羅 艷 李瑞蓮*

1.湖南省藥品檢驗(yàn)研究院，湖南 長沙 410001；2.湖南省藥品質(zhì)量評價工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410001

石淋通顆粒為廣金錢草經(jīng)提取加工制成，具有清濕熱、利尿、排石的作用，用于尿路結(jié)石、腎盂腎炎、膽囊炎[1]。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第八冊及國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-1520-93-1、WS3-B-1520-93-2 、WS3-B-1520-93-3、WS-11044(ZD-1044)-2002-2011Z、國家藥品標(biāo)準(zhǔn)修訂批件2000ZFB 0058所附石淋通顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等5個注冊標(biāo)準(zhǔn)，檢驗(yàn)項(xiàng)目較少，無法全面評價其質(zhì)量。而有關(guān)文獻(xiàn)僅對廣金錢草進(jìn)行夏佛塔苷、總黃酮的含量測定[2-3]。中藥制劑的成分復(fù)雜，在質(zhì)量控制中采用單一或幾個成分難以控制其整體質(zhì)量[4-6]。故本實(shí)驗(yàn)建立HPLC指紋圖譜，并確定其中幾個共有峰的成分，從整體上控制該制劑的整體質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀；AE200 型電子分析天平(德國梅特勒公司)；KQ-300TZ型超聲波清洗器(300W，30KHZ)；UV-TOC/UF型超純水系統(tǒng)(賽默飛)。 石淋通顆粒來自20家不同醫(yī)藥公司生產(chǎn)的20批次樣品，編號S1-S20，批號：171004、171003、170902、17070008、171002、17110032、1710006、1709009、170301、20170601、1710020、170502、171001、170902、20171110、667001、1709261、20170201、171201、170801)；廣金錢草(批號：121248-201104) 、夏佛塔苷(批號：111912-201703)均購自中國食品藥品檢定研究院；新西蘭牡荊苷2(批號：B21399)、異夏佛塔苷(批號：B21563)均購自上海源葉生物科技有限公司。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.4%磷酸水(B)，等度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：335 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 分別取新西蘭牡荊苷2、夏佛塔苷、異夏佛塔苷對照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成濃度分別為13.52 μg/mL、33.04 μg/mL、26.02 μg/mL的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品適量(相當(dāng)于廣金錢草2 g)，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加80%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，在 “2. 1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)測定6次，記錄色譜圖，以夏佛塔苷峰為參照峰，計算其他特征峰的相對保留時間，結(jié)果均小于1.0%，說明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批石淋通顆粒，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，各精密吸取10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6次測定，記錄色譜圖，以夏佛塔苷為參照峰，計算其他特征峰的相對保留時間，結(jié)果均小于1.0%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液 10 μL，在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下于配制后的0、4、8、12、20、24 h進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以夏佛塔苷為參照峰，計算其他特征峰的相對保留時間，結(jié)果均小于2.0%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜的建立與分析

2.4.1 石淋通顆粒指紋圖譜的建立與相似度評價 取20批石林通顆粒，依“2.2.2” 項(xiàng)方法制備供試品溶液并進(jìn)樣測定，記錄圖譜，標(biāo)記為S1～S20。20批樣品共標(biāo)出10個共有峰，經(jīng)與對照品比對，指認(rèn)3個特征峰，分別為新西蘭牡荊苷2(3號峰)、夏佛塔苷(7號峰)、異夏佛塔苷(10號峰)，以7號峰作為參照峰(S)，計算各特征峰與S峰的相對保留時間及相對峰面積，見圖1、表1、表2。

將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012年版)，以S1(171004)樣品為參照，經(jīng)過多點(diǎn)校正和數(shù)據(jù)匹配后，平均值法生成對照指紋圖譜R，與對照指紋圖譜比較20批石淋通顆粒的相似度數(shù)據(jù)，相似度均大于0.990，說明石淋通顆粒的質(zhì)量穩(wěn)定，見表3。

表1 20批樣品各峰的相對保留時間

表2 20批樣品各峰的相對峰面積

2.4.2 石淋通顆粒指紋圖譜的聚類分析 以所得20批樣品指紋圖譜的10個共有峰的峰面積為變量，導(dǎo)入SPSS 22.0軟件，選用平均組間連接聚類方法，以平方歐式距離法作為樣品間距離計算方法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)分類距離為20時，20批次石淋通顆粒可以分為2大類，S4、S12、S13、S17、S19號樣品聚為一類；其余樣品聚為一類。

表3 20批石淋通顆粒與對照指紋圖譜比較的相似度

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇 分別比較甲醇、80%甲醇、50%甲醇的提取效果。結(jié)果表明，80%甲醇的提取溶液中的色譜峰較其他2種提取溶液中的色譜峰更為豐富，因此選擇80%甲醇為提取溶劑。同時參考廣金錢草在《2015版中國藥典一部》的含量測定方法，采用超聲震蕩的提取方法。

3.2 檢測波長的選擇 使用PDA檢測器對樣品進(jìn)行210～400 nm的全波長掃描，并對各波長下的色譜圖進(jìn)行分析比較。結(jié)果表明，在335 nm下檢測到峰的數(shù)目較多，各峰分離良好，特征峰明顯且峰形較好，從圖譜中可以盡可能的獲取色譜組分信息以反映體系組成的全貌，因此選定335 nm為檢測波長。

3.3 流動相的選擇 由于石淋通顆粒化學(xué)成分簡單，劑型范圍小，故選擇等度洗脫。在流動相的篩選中，考察了乙腈-0.4%磷酸水系統(tǒng)、甲醇-0.4%磷酸水系統(tǒng)。結(jié)果顯示，乙腈-0.4%磷酸水系統(tǒng)的基線更穩(wěn)定，色譜峰個數(shù)較多，且擁有較好的分離度，因此選擇乙腈-0.4%磷酸水系統(tǒng)為HPLC分析的流動相系統(tǒng)。

3.4 色譜柱的選擇 考察3種不同型號色譜柱：Ecosil C18 (250 mm×4.6 mm×5 μm)、Agilent zorbax SB-C18 (250 mm×4.6 mm×5 μm)、Apollo C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)，結(jié)果表明Agilent zorbax SB-C18 (250 mm×4.6 mm×5 μm)柱分離出的色譜峰分離度好，峰數(shù)多，穩(wěn)定性好，故選擇Agilent zorbax SB-C18柱為分析色譜柱。

3.5 參照峰的選擇 廣金錢草標(biāo)準(zhǔn)收錄于《中國藥典》(2015年版一部)，其含量測定項(xiàng)目的指標(biāo)成分為夏佛塔苷。石淋通顆粒為廣金錢草的單方制劑，本研究建立的指紋圖譜10個特征峰中夏佛塔苷的峰面積最大、峰形好，與廣金錢草的指標(biāo)成分一致，最后選擇夏佛塔苷為參照峰(S峰)。在下一階段研究中，可以參考廣金錢草中夏佛塔苷的含量，對本制劑中的夏佛塔苷進(jìn)行定量研究。

4 結(jié)論

本研究運(yùn)用HPLC法建立了石淋通顆粒的指紋圖譜，基本反映了該品種的化學(xué)成分全貌，為全面控制石淋通顆粒的質(zhì)量提供一個新方法。通過對指紋圖譜的分析，確定了10個特征峰，以夏佛塔苷的峰為參照峰(S峰)，計算各特征峰與S峰的相對保留時間，其相對保留時間應(yīng)在規(guī)定值的±5%以內(nèi)。具體規(guī)定值為：0.41(峰1)、0.57(峰2)、0.61(峰3)、0.65(峰4)、0.70(峰5)、0.862(峰6)、1.000(峰7,S)、1.237(峰8)、1.289(峰9)、1.455(峰10)。