探索白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑對(duì)大鼠角膜移植術(shù)后Treg的影響

李 蘭，曹 倩，李 勇，李云川，鄒 瑩，龍俊君，劉浩文，何柳余

(昆明市第一人民醫(yī)院眼科，云南昆明 650000)

角膜移植術(shù)是目前角膜盲患者復(fù)明的唯一方式[1]，即使在局部和全身免疫抑制治療的前提下，患者的角膜移植術(shù)失敗率仍可能超過(guò)50%[2]。介導(dǎo)角膜移植術(shù)排斥反應(yīng)的細(xì)胞和分子機(jī)制還不十分清楚。大量研究提示，炎性因子介導(dǎo)的炎性反應(yīng)是角膜移植術(shù)排斥反應(yīng)發(fā)生的基礎(chǔ)，其中白細(xì)胞介素-lβ(interleukin-1β，IL-1β)是關(guān)鍵因子[3-4]。CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)為參與眼前房相關(guān)免疫偏離的重要細(xì)胞[5]，近年來(lái)成為研究熱點(diǎn)。目前研究表明炎性微環(huán)境下多聚泛素化作用可導(dǎo)致Foxp3蛋白降解，Treg免疫抑制功能受損[6]。為了解角膜移植術(shù)術(shù)后白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist，IL-1ra，美國(guó)Selleck公司)對(duì)IL-1β、Treg及排斥反應(yīng)的影響，本文建立心臟死亡供體(donation after cardiac death，DCD)大鼠角膜移植術(shù)模型后，受體SD大鼠玻璃體腔注射IL-1ra，觀察角膜移植術(shù)情況并檢測(cè)SD大鼠全血、淋巴結(jié)中IL-1β、Treg水平，旨在為角膜移植術(shù)排斥反應(yīng)的防治提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠，體重220～250 g，8～10周齡，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼料由江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司提供，清潔級(jí)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)程序經(jīng)過(guò)昆明市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查批準(zhǔn)通過(guò)(批準(zhǔn)號(hào)：YLS2020-119)。

1.2 方法

1.2.1供體準(zhǔn)備

取12只SD大鼠，使用5 mL注射器抽取5 mL空氣于大鼠左側(cè)肋骨角偏左上方心臟方向處進(jìn)針，回抽見(jiàn)血液確定穿刺部位位于心腔，注射5 mL空氣處死大鼠，建立心臟死亡模型。5%～10%聚維酮碘消毒右眼結(jié)膜囊5 min，生理鹽水沖洗結(jié)膜囊。沿角膜緣360°剪下全層角膜供體，4.25 mm環(huán)鉆制作角膜植片置于Optisol保護(hù)液中備用。

1.2.2受體準(zhǔn)備

共24只SD大鼠，采用硬幣法分為磷酸鹽緩沖液(PBS)組與IL-1ra組，各12只。采用10%水合氯醛按照3 mL/kg行大鼠腹腔麻醉后以鹽酸奧布卡因滴眼液滴右眼，4.0 mm環(huán)鉆制作好植床。

1.2.3角膜移植術(shù)

取DCD大鼠角膜植片，分別在受體大鼠內(nèi)行穿透性角膜移植術(shù)，將供體角膜植片置于受體植床上，使用12-0國(guó)產(chǎn)顯微縫線進(jìn)行間斷縫合8針，線節(jié)不埋藏，前房?jī)?nèi)注入空氣約0.1 mL形成前房。術(shù)畢，按照實(shí)驗(yàn)分組，PBS組玻璃體腔注射PBS 1 IU，IL-1ra組玻璃體膜注射IL-1ra 1 IU，結(jié)膜囊內(nèi)點(diǎn)妥布霉素眼膏，6-0縫線縫合眼瞼中部防止術(shù)后大鼠抓撓眼部引起感染，術(shù)后24 h剪開(kāi)眼瞼縫線，點(diǎn)妥布霉素眼膏，1次/天，連續(xù)使用1周。

1.2.4觀察指標(biāo)

(1)角膜移植術(shù)排斥反應(yīng)情況評(píng)分：術(shù)后用體視鏡每周觀察并拍照記錄術(shù)眼角膜水腫、角膜混濁、新生血管情況，由同一醫(yī)生進(jìn)行角膜移植術(shù)排斥反應(yīng)評(píng)分，3項(xiàng)評(píng)分之和為排斥指數(shù) (rejection index，RI)，當(dāng)RI≥6，確定為排斥[7]。(2)分別于術(shù)后1、3、5周處死每組大鼠各4只，取外周血、淋巴結(jié)，ELISA法檢測(cè)IL-1β表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Treg數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大鼠全血和淋巴結(jié)中IL-1β水平比較

術(shù)后1、3、5周,兩組全血、淋巴結(jié)IL-1β水平逐漸降低，Treg數(shù)量均逐漸升高，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后1、3、5周，IL-1ra組大鼠全血、淋巴結(jié)中IL-1β水平均明顯低于PBS組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1、2。

表1 大鼠角膜移植術(shù)后全血IL-1β水平比較

表2 大鼠角膜移植術(shù)后淋巴結(jié)中IL-1β水平比較

續(xù)表2 大鼠角膜移植術(shù)后淋巴結(jié)中IL-1β水平比較

2.2 大鼠全血和淋巴結(jié)Treg數(shù)量比較

術(shù)后1、3、5周，兩組全血、淋巴結(jié)Treg數(shù)量逐漸升高，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3、4。術(shù)后1周PBS組全血Treg數(shù)量與IL-1ra組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.090)，見(jiàn)表3，圖1A。術(shù)后3、5周，IL-1ra組全血Treg數(shù)量高于PBS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后1、3、5周，IL-1ra組淋巴結(jié)Treg數(shù)量均高于PBS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4，圖1B。

表3 大鼠角膜移植術(shù)后全血Treg數(shù)量比較

A:全血；B:淋巴結(jié)。

表4 大鼠角膜移植術(shù)后淋巴結(jié)Tregs數(shù)量比較

2.3 角膜移植術(shù)排斥情況評(píng)分比較

術(shù)后1、3、5周，兩組RI逐漸增加；術(shù)后1周，IL-1ra組與PBS組大鼠RI比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.337 5)；術(shù)后3、5周，IL-1ra組大鼠RI均低于PBS組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表5。

圖2 體視顯微鏡觀察移植角膜移植術(shù)排斥反應(yīng)情況(6.5×)

表5 大鼠角膜移植術(shù)術(shù)后RI比較

3 討 論

角膜移植術(shù)術(shù)后角膜植片的透明性主要通過(guò)3種方法來(lái)維持：(1)抑制角膜異體免疫應(yīng)答；(2)誘導(dǎo)免疫耐受；(3)清除存在于移植物-宿主處的可溶性細(xì)胞因子和膜結(jié)合蛋白或阻斷免疫效應(yīng)物[8-9]。近年來(lái)，研究者致力于通過(guò)增加外源性Treg的數(shù)量來(lái)抑制角膜移植術(shù)術(shù)后排斥反應(yīng)，延長(zhǎng)角膜植片的存活時(shí)間。研究表明，角膜移植術(shù)后的微環(huán)境是一種炎性環(huán)境，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)中和性抗體及天冬氨酸特異性胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)抑制劑可有效延緩角膜移植術(shù)排斥反應(yīng)的發(fā)生，開(kāi)拓了角膜移植術(shù)免疫排斥防治的新思路[10-11]。本實(shí)驗(yàn)在DCD大鼠角膜移植術(shù)術(shù)畢于受體大鼠玻璃體腔內(nèi)注射IL-1ra，并檢測(cè)到術(shù)后全血及淋巴結(jié)中Treg數(shù)量增加。

眼前節(jié)免疫赦免機(jī)制在角膜移植術(shù)術(shù)后受到破壞，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)于角膜植片及房水中。以往的實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，角膜移植術(shù)術(shù)后眼前房?jī)?nèi)有大量巨噬細(xì)胞聚集，并可見(jiàn)巨噬細(xì)胞黏附于角膜內(nèi)皮[11]。巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生TNF、IL-6等多種炎性細(xì)胞因子，是角膜移植術(shù)術(shù)后早期浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞，這表明角膜移植術(shù)術(shù)后的微環(huán)境是一種炎性環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PBS組角膜移植術(shù)術(shù)后全血、淋巴結(jié)中IL-1β水平較IL-1ra組明顯升高；IL-1ra組術(shù)后1、3、5周全血和淋巴結(jié)中IL-1β水平均明顯下降，且術(shù)后5周IL-1β水平降至最低，表明IL-1ra可明顯抑制大鼠角膜移植術(shù)術(shù)后前房?jī)?nèi)炎性反應(yīng)。

Treg在免疫穩(wěn)態(tài)的建立與維持中起重要作用，不僅對(duì)T淋巴細(xì)胞具有抑制增殖、促進(jìn)凋亡的作用，而且可以負(fù)向調(diào)控B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、自然殺傷T淋巴細(xì)胞(NKT細(xì)胞)等多種免疫細(xì)胞的生物功能[12-13]，是參與眼前房相關(guān)免疫偏離的重要細(xì)胞類型之一[14]。有研究表明，IL-1β刺激下Treg減少，增加了角膜移植術(shù)術(shù)后排斥反應(yīng)發(fā)生的概率[15-16]。本研究中，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)術(shù)后1、3、5周IL-1ra組全血、淋巴結(jié)中Treg數(shù)量均升高，且術(shù)后5周升至最高，而全血檢測(cè)到IL-1β水平逐漸降低，在術(shù)后5周時(shí)降至最低，說(shuō)明IL-1ra抑制了炎性因子的表達(dá)，促進(jìn)了Treg增殖。角膜移植術(shù)后排斥反應(yīng)評(píng)分表明，隨著時(shí)間延長(zhǎng)RI增加，但I(xiàn)L-1ra組RI在術(shù)后3周開(kāi)始較PBS組明顯降低。

綜上所述，大鼠角膜移植術(shù)術(shù)后玻璃體腔注射IL-1ra可降低全血、淋巴結(jié)中IL-1β水平，增加全血、淋巴結(jié)中Treg數(shù)量，減輕術(shù)后排斥反應(yīng)。但I(xiàn)L-1ra具體是通過(guò)何種通路作用于Treg，抑制角膜移植術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生，仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。