國內部分地區豬場豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測及高致病性毒株的分離與毒力鑒定

沙俊舟，焦文濤，丁旭娜，段進坤，車艷杰，鮑恩東1,*

(1.南京農業大學動物醫學院，南京 江蘇 210095；2.天津瑞普生物技術股份有限公司研究院，天津 300308)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一種高度接觸性豬的傳染病，可引起母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道異常等病癥。PRRS由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起，因其可引起病豬耳部和皮膚發紺，又稱豬藍耳病。上世紀80年代末到90年代初，PRRS在北美和歐洲相繼暴發，并迅速擴散、傳播至許多養豬國家和地區[1-2]。該病病原先后在歐洲、美國被分離到，雖然兩株病毒的基因組結構和引起的癥狀相似，但是他們的核苷酸相似度只在60%左右，所以PRRSV就被分為北美型和歐洲型兩個基因型[3-4]。1995年，PRRS傳入中國，毒株屬美洲型[5-6]。2006年，中國南方地區又暴發了PRRS，該病病原為美洲型的突變株，命名為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV)，該病毒的nsp2區域和經典株相比，存在30(1+29)個不連續氨基酸的缺失[7-8]。2014年開始，有人從我國養豬場分離到一類與 2008 年在美國分離到的NADC30毒株有很高的核苷酸相似性的 PRRSV；自此，這類毒株在我國養豬場中開始被頻繁發現，人們將此類毒株命名為類 NADC30(NADC30-like)毒株[9-10]。目前，我國PRRS防控形勢嚴峻，PRRS在我國呈現出全國性流行的態勢，且流行毒株具有多樣性[11-14]。在眾多毒株中，高致病性毒株致病性強，臨床癥狀嚴重，極大地危害著養豬業的發展，仍需引起高度重視。

PRRSV為單股正鏈有囊膜的RNA病毒，屬套式病毒目、動脈炎病毒科中的豬動脈炎病毒屬[15]。病毒全長大約為15.0～15.4 kb，不同毒株的病毒大小差異主要集中在ORF1a上的nsp2基因區域。病毒5′端有非編碼區和帽狀結構，3′端也存在非編碼區和poly(A)[16]。PRRSV至少包含10個開放閱讀框(ORFs)。其中，ORF1a和ORF1b占病毒基因組全長的3/4，分別編碼病毒的復制酶多聚蛋白pp1a和pp1ab，并且能被自剪切成14個非結構蛋白(nsps)，從5′到3′分別為nsp1α/β、nsp2-6、nsp7α/β和nsp8-12，參與病毒基因組的復制和轉錄[17]。ORF2～ORF5、ORF6、ORF7占據基因組剩下的1/4，分別編碼病毒的囊膜蛋白GP2～GP5、膜基質蛋白M和核衣殼蛋白N[16]。位于ORF1a中的nsp2基因變異程度最大，最多可容忍400個氨基酸的缺失，是不同毒株的主要鑒別位點。隨著PRRSV重組和變異的頻率加劇，GP5基因也在遺傳變異分析中作為基因分型的依據[18-19]。

本研究主要采用國標RT-PCR方法[20-21]，對2017 至 2019年間采集自國內14省(市)的臨床發病動物疑似樣本，進行了流行病學調查，并以此分離到一株PRRSV毒株(命名為RP19)，對該分離病毒的nsp2和ORF5進行序列分析，并通過動物回歸試驗等確定了該毒株的致病性，為PRRS的防控及疫苗研制提供了一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來源

病料自安徽省、河北省、河南省、江蘇省、江西省、山西省、陜西省、湖北省、山東省、福建省、甘肅省、北京市、天津市、上海市14省、市的多個不同規模豬場。組織、精液以及臍帶血等共1 441份樣品均由天津渤海農牧聯合研究院監測中心分別于2017至2019年間收集并提供。

1.2 試驗動物、細胞及試劑

7頭約5周齡試驗用仔豬購自天津市周邊豬場，均為經PRRSV、PRV、PCV2核酸檢測陰性和PRRSV ELISA抗體檢測陰性的健康試驗豬；Marc-145細胞、鼠源PRRSV N蛋白單抗由天津瑞普生物技術股份有限公司生物制品研究院提供；DH5α購自上海唯地生物公司；pEASY-Blunt載體購自北京全式金生物公司；RNAisoPlus、ExTaq酶、反轉錄試劑盒購自寶生物工程公司；Phanta高保真DNA聚合酶購自南京諾唯贊生物公司；山羊抗小鼠Alexa Fluor?488標記的二抗購自艾博抗貿易有限公司；膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自天根生化科技公司；PRRSV Ab ELISA試劑盒購自北京金諾百泰生物公司。

1.3 引物的設計合成

采用國標引物對收集到的病料進行擴增。GB2008為PRRSV的鑒定引物，GB2011為PRRSV分型引物，可鑒別經典株和HP株。此外，根據GenBank中發布的PRRSV序列，設計2對特異性引物用于部分nsp2基因和ORF5基因的序列擴增，引物由金唯智生物公司合成(表1)。

表1 擴增引物序列

1.4 病毒檢測

1.4.1 樣品處理

分別剪取0.3 g左右的病料組織(肺臟、胸腺、淋巴結等)，置于2 mL離心管中，加入1 mL PBS，于勻漿器中進行研磨勻漿，13 000 r/min離心5 min，取上清液轉移至新的1.5 mL離心管中，-20 ℃凍存備用。

對于臍帶血樣品，將血液靜置析出血清后，加入2 mL于離心管中，3 000 r/min離心5 min，取上清轉移至新的1.5 mL離心管中，-20 ℃凍存備用。

對于精液樣品，將其混勻后，置于1.5 mL離心管中，-20 ℃凍存備用。

1.4.2 核酸的提取與RT-PCR鑒定

取200 μL樣品，根據RNAiso Plus參考說明進行RNA提取，使用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit進行cDNA反轉錄，用ExTaq酶分別對兩組引物進行PCR擴增。

12.5 μL的體系分別為：①10×PCR Buffer 1.25 μL、dNTPs 0.5 μL、GB2008上、下游引物各0.5 μL、ddH2O 7 μL、ExTaq酶 0.25 μL、cDNA模板 2.5 μL；②10×PCR Buffer 1.25 μL、dNTPs 0.5 μL、GB2011 P1、P2、P3引物各0.5 μL、ddH2O 6.5 μL、ExTaq酶 0.25 μL、cDNA模板 2.5 μL。

擴增程序分別為：①95 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，51 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃最后延伸10 min；②95 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，59 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環；72 ℃最后延伸10 min。

PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳120 V，30 min進行檢測。

1.5 病毒的分離鑒定

1.5.1 PAM的制備

將6～8周齡的PRRSV、PCV2核酸和抗體檢測陰性的仔豬動脈放血致死后，從喉頭部切開，止血鉗盡量靠上夾住氣管(密閉)，下端勿夾住肺，無菌操作取出肺，用無菌PBS沖洗至無新鮮血液，進入無菌間，用酒精點燃擦拭肺臟表面。用滅菌剪刀盡量剝離氣管周圍的粘連物，用滅菌鑷子夾住肺氣管側壁，用50 mL注射器向肺臟灌含8%雙抗的PBS 150～200 mL，輕輕揉捏拍打，使肺泡充分打開。將灌洗液傾入瓶口覆有無菌雙層紗布的三角瓶中，重復灌洗3～4次，收集灌洗液(約500 mL)，直至肺臟間隙呈透明狀。灌洗液1 000 r/min離心10 min，棄上清液。沉淀物用20 mL含10%新生牛血清的PRMI1640培養基重懸，1 000 r/min離心10 min。用培養基將細胞重懸，10倍、100倍稀釋后進行細胞計數，使六孔板每孔含5×105個細胞。

1.5.2 病毒的分離

將PCR鑒定為HP毒株的陽性病料組織上清液用0.22 μm濾器過濾后，分別接種PAM細胞和Marc-145細胞。將生長良好的6孔板細胞培養基棄去，用PBS沖洗細胞2次，按病毒液與培養基1∶10的比例接種。37 ℃孵育1 h，棄去上清液，使用含3%新生牛血清的培養基2 mL，置于細胞培養箱中繼續培養3～5 d，傳2～3代，約80%細胞出現CPE后收取樣品，將病毒液置于-80 ℃保存備用。

1.5.3 病毒滴度測定

用長滿單層Marc-145細胞的96孔細胞培養板進行病毒滴度測定。將在Marc-145細胞上穩定傳代的第3代病毒，用含2%新生牛血清的DMEM培養基作10×倍比稀釋，取10-2～10-6稀釋度的病毒液分別接種96孔細胞培養板。每個稀釋度接種8孔，每孔100 μL。同時設8孔作為陰性對照，每孔再補加100 μL 維持培養基。置于37 ℃ 5% CO2細胞培養箱中培養，每日觀察細胞病變，連續觀察4～5 d，記錄每個稀釋度出現CPE的孔數。采用Reed-Muench法計算TCID50。

1.6 病毒電鏡觀察

將接毒后的Marc-145細胞培養72 h后，反復凍融3次，10 000 r/min 離心15 min，去掉細胞碎片。取上清液，加入終濃度7%的PEG6000，混勻后于4 ℃過夜沉淀。將PEG與病毒的混合液10 000 r/min離心30 min。棄去上清，用 1.5 mL 無菌PBS重懸附著于離心管底部的病毒粒子，負染后進行電鏡觀察。

1.7 間接免疫熒光試驗(IFA)

將Marc-145細胞上培養24 h的第3代病毒，棄去培養基，用PBS洗滌3次。使用-20 ℃預冷的甲醇在-20 ℃環境下固定細胞10 min。除去甲醇，用PBST清洗2次，每次5 min。以2%的BSA溶于PBST作為稀釋液，按1∶2 000的比例對鼠源單抗進行稀釋，加入單抗，37 ℃孵育1 h。PBST清洗3次細胞，每次5 min。用1∶1 000比例以上述稀釋液稀釋Alexa Fluor?488標記二抗，加入二抗，37 ℃孵育1 h。PBST清洗3次細胞，每次10 min。在熒光顯微鏡下觀察結果。

1.8 擴增nsp2基因和ORF5基因

以Phanta高保真酶分別擴增RP19的nsp2基因和ORF5基因。PCR擴增體系為50 μL，2×Phanta Max Master Mix 25 μL、ddH2O 19 μL、上、下游引物各2 μL，cDNA模板2 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃最后延伸5 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將目的條帶裁切回收，膠回收后，根據說明書方法連接pEASY-Blunt載體，并轉化DH5α感受態。涂布過夜后挑取經PCR鑒定為陽性的菌落，提取質粒送往金唯智生物公司測序。

1.9 序列分析

從GenBank上下載國內外PRRSV代表毒株，毒株信息見表2。將nsp2和ORF5基因的序列通過Lasergen與Mega 7.0軟件進行序列比對，構建進化樹，并把氨基酸序列與代表毒株進行比對分析。

表2 PRRSV參考毒株信息

1.10 動物回歸試驗

取7頭試驗仔豬，隨機分為2組，其中攻毒組5頭和對照組2頭。攻毒組的每頭仔豬滴鼻2 mL，病毒含量105.0TCID50/mL。對照組滴鼻DMEM 2 mL。每日進行直腸測溫，并觀察臨床癥狀。在攻毒后0、3、7、11、21 d分別采血，分離血清，使用PRRSV Ab ELISA試劑盒檢測N蛋白抗體。每7日進行一次體重測量，連續觀察21 d。所有存活仔豬采用安樂死在21 d進行剖檢。觀察其肺臟大體的病變，并用10%福爾馬林溶液固定保存肺組織，以備組織病理學檢查。

2 結果

2.1 病料樣品RT-PCR檢測

通過對14個省(市)共計1 441例疑似病料的GB2008引物檢測，部分樣品擴增結果見圖1。經RT-PCR擴增為陽性的病料有319份，陽性檢出率為22.14%，其中病料陽性檢出率較高的地區有江西省41.94%(39/93)、安徽省39.73%(29/73)、上海市35.94%(23/64)。病料陽性檢出比例較低的地區有福建省17.35%(17/98)、江蘇省10%(3/30)、天津市6.9%(2/29)。經GB2011引物擴增為HP-PRRSV感染的樣品有169例，占陽性病料的52.98%(169/319)，說明感染了HP-PRRSV，該毒珠仍為近幾年PRRSV的流行毒株。

2.2 病毒的分離

將處理的陽性病料上清液接種PAM細胞，只有1份病料接種72 h后產生明顯的細胞病變，表現為細胞破碎、皺縮、脫落；其他陽性病料未出現細胞病變，盲傳3代后仍未出現病變棄掉。該毒株命名為RP19。將RP19株接種Marc-145細胞后，細胞病變時間顯著增長。96 h只是出現細胞部分變圓和聚集，直到120 h才出現細胞破碎、脫落現象。

2.3 病毒滴度測定

經TCID50測定，RP19于Marc-145細胞上第3代的病毒含量為105.9TCID50/mL。

M.DL2000 DNA Marker；1～8.部分檢測樣品；9.陽性對照；10.陰性對照;A.GB2008引物擴增結果;B.GB2011引物擴增結果圖1 部分樣品的PCR擴增結果

2.4 病毒電鏡觀察

病毒樣品經過負染后，透射電鏡下可觀察到呈現球狀的病毒粒子，直徑約50～72 nm，表面有微小的纖突，見圖2。

圖2 病毒粒子透射電鏡觀察

2.5 間接免疫熒光試驗

對在Marc-145細胞上培養24 h的RP19進行間接免疫熒光試驗觀察。正常細胞，無綠色熒光(圖3A)，而大量病毒感染細胞出現特異性綠色熒光(圖3B)。

A.陰性細胞對照;B.RP19感染24 h后的細胞圖3 PRRSV間接免疫熒光測試結果(100×)

2.6 nsp2基因和ORF5基因的擴增

分別對nsp2和ORF5基因對RP19株進行PCR擴增。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，nsp2目的條帶大小為950 bp，ORF5目的條帶大小為640 bp(圖略)，均與預期結果相符。

2.7 序列分析

使用MEGA7.0軟件，采用Neighbor-Joining法對RP19與國內外代表性毒株分別進行nsp2基因和ORF5基因的進化樹構建。美洲型分為以VR-2332為代表的經典株、以JXA1為代表的HP株和以NADC30為代表的NADC30-like毒株。RP19株在進化樹上屬于HP毒株，與TJ株最為接近。

使用MegAlign軟件對nsp2基因和ORF5基因和國內外代表毒株進行氨基酸序列比對，結果如圖4顯示。RP19毒株的nsp2基因具有典型HP毒株特征，即與經典毒株相比具有30(1+29)個氨基酸的不連續缺失。ORF5基因的氨基酸比對結果顯示，雖然核苷酸有些許不同，但為氨基酸不變的同義突變，RP19的信號肽、中和表位和3段跨膜區都與JXA1、TJ、HuN4等HP株一致(圖4)。nsp2與ORF5基因的序列分析結果表明，此次分離RP19株為典型的HP-PRRSV。

圖4 ORF5基因氨基酸對比結果

2.8 動物回歸試驗

5周齡受試仔豬在感染RP19毒株后第3天后開始出現體溫升高，持續約7～10 d，體溫在攻毒后的第5～8天時達到高峰，13 d后體溫逐漸下降并恢復至正常(圖5)。攻毒后受試仔豬出現采食減少、精神沉郁等癥狀。于攻毒后第4天出現呼吸急促、喜臥等癥狀，并伴有咳嗽、噴嚏。攻毒后第7天受試仔豬出現皮膚潮紅、顫抖、后肢麻痹等癥狀。5頭仔豬在感染后期出現1頭死亡。陰性對照組的各受試仔豬在整個試驗過程中體溫、采食和精神狀態均表現正常，未觀察到任何異常現象。

圖5 試驗仔豬直腸溫度變化

各組受試仔豬在攻毒前均稱量體重并記錄。此后每周測一次，于試驗結束宰殺后分析其體重增長情況，試驗結果見圖6。攻毒組豬在0～7 d、7～14 d、14～21 d這3個時間段的日增重均顯著低于對照組(P<0.01)。

**表示差異極顯著(P<0.01)圖6 試驗仔豬平均日增重

各組受試仔豬血清中抗行檢測結果顯示，仔豬在攻毒前抗體水平均處于檢測限以下，對照組受試仔豬在整個試驗期間的血清抗體水平均為陰性，而攻毒組受試仔豬的血清抗體于第7天開始被檢測到，隨后抗體水平隨著試驗時間的延長而不斷升高，直到試驗結束(圖7)。

圖7 試驗仔豬血清中PRRSV抗體水平變化

在攻毒后21 d對所有存活試驗豬均進行安樂死并剖檢。剖檢結果顯示，攻毒組仔豬的肺臟出現淤血水腫，肺臟邊緣出現實質性病變(圖8)。病理組織學觀察結果顯示，攻毒組仔豬的肺臟出現以彌散性間質性肺炎為特征的變化，肺間質中結締組織出現增生，肺泡巨噬細胞數量增多，肺泡間隔淋巴細胞和單核細胞浸潤，大部分肺泡消失，剩余的肺泡出現代償性擴張(圖9)。

A.對照組仔豬肺臟;B.攻毒組仔豬肺臟圖8 仔豬肺臟大體觀察

A.對照組肺組織；B.攻毒組肺組織間隔明顯增寬，肺泡消失且有代償性肺泡擴張圖9 仔豬肺臟的病理組織學變化(100×)

3 討論

PRRS是一種對全球養豬業具有重大影響的傳染病。從上世紀80年代在美國被首次分離后就一直影響著養豬業的發展。我國PRRS的流行經歷了三個階段：1996年以Ch-1a為代表的經典株流行；2006年以JXA1為代表的HP株流行；2014年至今以NADC30為代表的類NADC30株流行。PRRSV為RNA病毒，極易變異，其ORF1a編碼的nsp2基因能忍受大片段的基因突變和缺失，并且這種突變可不斷地累加。另外，不同毒株之間會頻繁發生基因重組[11,21]。尤其是國外引種、免疫弱毒活疫苗等方式不規范等，導致了國內國外毒株的重組、野毒疫苗毒毒株的重組等問題，而且弱毒疫苗存在毒力返強風險，加劇了PRRS的流行。

PRRS是影響我國養豬業時間最持久、損失最嚴重的動物疫病之一，尤其是2006年暴發的HP-PRRS，由于其高致病率和高死亡率的特征，對我國養豬業造成了巨大的經濟損失。

本研究以國標RT-PCR檢測方法為基礎，通過對2017至2019年期間采自我國14省(市)的1 441份PRRS感染疑似病料進行檢測而開展起來的。結果顯示，共有319份病料樣品的檢測結果為陽性，陽性率為22.14%，其中HP-PRRSV感染的樣品約占陽性病料的52.98%，說明HP-PRRS至今已經在國內養豬場廣泛流行，仍需對其進行重點防范。另外，PRRS在不同地區養豬場的流行狀況是存在一定差異的，江西、安徽、上海等地養豬場中PRRS的感染情況比較嚴重，HP-PRRSV株占大多數，需要進行針對性的防控。

通過對篩選到的PRRS陽性病料進行處理，并接種到PAM細胞和Marc-145細胞，利用電鏡觀察、IFA以及HP-PRRSV特異性引物進行鑒定、動物回歸試驗等方法，成功分離到1株HP-PRRSV(RP19)。因2019年采集到的病料較少，且病料沒有立即進行病毒分離，目前只分離到1株病毒。為進一步探究該毒株RP19的遺傳演化規律，對其關鍵性的nsp2基因和ORF5基因進行測序分析，結果顯示RP19與HP代表毒株TJ株最為接近。ORF5基因編碼GP5蛋白，GP5蛋白存在免疫原性較高的抗原表位，而抗原表位一定程度上決定了病毒的免疫特性。在ORF5的比對中發現，GP5蛋白重要的氨基酸位點未發生突變，呈現典型的HP毒株的特點。為了驗證RP19的致病性，本文還對5周齡仔豬進行了攻毒試驗，試驗結果表明，RP19株能引起仔豬嚴重的臨床癥狀，有一定的致死毒力，可引起感染仔豬發生彌散性間質性肺炎等病理變化及相應的臨床癥狀。

由于HP-PRRS依然為國內流行毒株，HP-PRRSV占PRRSV陽性樣品的52.98%，且存在高度傳染性、致病性，因此以HP-PRRSV為抗原制備疫苗預防PRRS非常必要。本研究結果為國內PRRSV的疫苗生產和使用提供了一定的試驗依據。