乳腺癌患者循環(huán)腫瘤細胞陽性率與預后的關系

張 潔，楊 猛，彭維朝，陳 平，魯 瑤，馬宏光，黃林平

（中日友好醫(yī)院 普外科，北京 100029）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，美國2020年預計新發(fā)乳腺癌27640 例，高居所有女性惡性腫瘤第一位； 預計死于乳腺癌的女性患者42170例，位于女性所有惡性腫瘤死因第2 位[1]。在我國乳腺癌的發(fā)病率和死亡率也逐年上升[2]。循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是可在腫瘤患者外周血中檢測到。研究表明，CTCs 檢測對乳腺癌預后判斷、 治療效果評價及復發(fā)監(jiān)測具有重要意義[3]。我們前瞻性收集了原發(fā)性乳腺癌外周血標本，利用密度梯度離心富集及上皮標記物細胞角蛋白（pan-cytokeratin，CK）聯(lián)合上皮黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，Ep-CAM） 免疫細胞化學方法檢測CTCs，以探討乳腺癌外周血CTCs 陽性率與原發(fā)腫瘤臨床病理特征及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 標本來源及患者臨床資料

前瞻性收集中日友好醫(yī)院普外科2014年1月～8月收治的乳腺癌患者術前外周血樣本41份，采集每名受試者清晨空腹外周血10ml。患者年齡28～84 歲，中位年齡53 歲；≥53 歲的22 例（53.7%），＜53 歲的19 例（46.3%）。

組織病理類型為浸潤性導管癌32 例，其他類型者9 例。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會2017年第八版乳腺癌分期標準對患者行TNM 分期。所有入組患者均進行電話隨訪。

1.2 密度梯度離心法富集CTC

將PBS 及人淋巴細胞分離液 （Ficoll PaqueTMPlus，GE Healthcare） 從冰箱取出放置在室溫預熱。將含EDTA 抗凝管收集的乳腺癌患者外周血10ml 加入到等體積淋巴細胞分離液中，1500r/min離心20min，吸取中間有核細胞層，加入PBS 洗滌，并再次離心，棄去上清液，加入蒸餾水洗滌并離心2 次，棄去上清液，向白色沉淀中加入PBS 200滋l，并將細胞懸浮，制作細胞涂片20 張，自然風干后，用中性福爾馬林固定15min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CTC 檢測

1.3.1 甲苯胺藍染色

吸取甲苯胺藍染色液100滋l 覆蓋已固定CTC玻片標本，自來水流水沖洗，除去浮色。由同一檢驗員顯微鏡下讀片。

1.3.2 免疫細胞化學法檢測CTC

將已固定CTC 玻片浸入0.3%過氧化氫溶液中氧化15min，阻斷內源性過氧化物酶。用0.01M PBS 洗滌5min、3 次，孵育一抗（鼠抗人pan-CK抗體1：200，兔抗人EPcam 抗體1：100），4℃過夜。0.01M PBS 洗滌5min、3 次，二抗（DAKO A液）孵育1～3h，0.01M PBS 洗滌5min、3 次。然后利用即用型DAB 液顯色，顯微鏡下控制顯色時間，0.01M PBS 終止顯色。Meyer 蘇木素復染細胞核1min，流水沖走浮色。梯度酒精各脫水2min，二甲苯透明10min，中性樹膠封片。由同一檢驗員顯微鏡下讀片。

1.4 原發(fā)性腫瘤的免疫組化檢測結果的判讀

（1）雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR）：≥1%癌細胞核著色；ER 和（或）PR（+）定義為激素受體（+）。（2）Ki67：計數(shù)1000 個癌細胞中細胞核著色的百分數(shù)，＜15%定義為低表達，≥15%為高表達。（3）HER-2：癌細胞中細胞膜無著色為（0）；任何比例的癌細胞顯示弱的、 不完整的細胞膜著色，或＜10%的癌細胞顯示弱的、完整的細胞膜著色為（+）；≥10%的癌細胞顯示弱的或中度的完整細胞膜著色，或＜30%的癌細胞顯示一致的、強的、完整的細胞膜著色為（++）；≥30%的癌細胞顯示一致的、強的、完整的細胞膜著色為（+++）。（0）或者（+）定義為陰性；（+++）定義為陽性；（++）為不確定狀態(tài)，均行熒光原位雜交技術檢測進一步明確HER-2 狀態(tài)。

表1 乳腺癌患者外周血CTC 與臨床病理因素的關系

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS17.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用（±s）表示。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗或者Fisher 精確概率法。

2 結果

2.1 乳腺癌患者外周血CTCs 的鑒定

利用甲苯胺藍染色及上皮細胞標記物細胞角蛋白（CK）及上皮黏附分子（Ep-CAM）檢測到了乳腺癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細胞的存在。甲苯胺藍染色顯示細胞核藍染，可見細胞核增大的CTCs（見圖1A 箭頭所示，封三）。進一步利用上皮細胞標記物進行免疫細胞化學法證實，結果顯示CK染色陽性（圖1B，見封三）以及Ep-CAM 染色陽性（圖1C，見封三）的即為CTCs。

圖1 乳腺癌患者外周血CTC的鑒定

2.2 CTC 與原發(fā)性乳腺癌臨床特點的關系

表1 示，乳腺癌患者外周血CTC 陽性率在不同乳腺癌分子分型、原發(fā)腫瘤分期（T）及TNM 分期亞組之間具有顯著性差異（均P＜0.05）。而在不同患者年齡、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、Ki67、Her-2 表達、淋巴結分期（N）、遠處轉移（M）亞組間無顯著性差異（均P＞0.05）。

失訪6 例，其它患者隨訪時間73～80 個月，平均75.9±2.59 個月。CTC 陽性組與CTC 陰性組在遠處轉移及死亡發(fā)生率方面差異無統(tǒng)計學意義（P=0.555）（見表1）。CTC 陽性組在隨訪期間發(fā)生骨轉移1 例、肺轉移2 例、死亡2 例。CTC 陰性組在隨訪期間發(fā)生骨轉移1 例、死亡1 例，死于化療副作用。

3 討論

CTCs 是指自發(fā)或因診療操作由原發(fā)部位進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞，并在一定條件下可發(fā)展為轉移灶。于1896年由澳大利亞的Ashworth首次提出。血液中CTCs 的存在與腫瘤的微轉移密切相關[4]，已在肺[5]、結腸[6]等不同實體腫瘤中發(fā)現(xiàn)且具有預后意義。目前，外周血中的CTCs 提供了一種易于獲得的惡性細胞群，是一種實時的“液體活檢”標記物[7，8]。

我們前瞻性收集了41 例乳腺癌患者外周血，利用密度梯度離心進行CTCs 富集，甲苯胺藍染色進行形態(tài)學分析以及利用上皮細胞標記物Epcam 和CK 免疫細胞化學方法鑒定CTCs。當前常用的CTCs 檢測方法存在局限性，CTCs 檢測方法包括細胞富集及腫瘤細胞鑒定2 個部分。CTCs富集是CTCs 檢測的難點，也是CTCs 計數(shù)及分子特征檢測的技術關鍵[9]。利用CTCs 密度、體積大小、細胞剛性和電性能等物理性質與血細胞不同，可實現(xiàn)對CTCs 初步篩選，其中最常用的是密度梯度離心法。物理富集方法的優(yōu)點是操作簡便、價格相對低、 對CTCs 活性影響小和便于進行下游分析。CTCs 的鑒定在蛋白質分子水平利用CTCs表面的特有分子以區(qū)分腫瘤細胞和血細胞，通常基于抗原抗體反應的原理。最常用的特異性標記物有EpCAM 和CK 等。

我們進一步探討了CTCs 陽性率與臨床病理特征及預后的關系，結果表明乳腺癌患者外周血CTC 陽性率在乳腺癌分子分型、 原發(fā)腫瘤分期（T）及TNM 分期方面具有顯著性差異（P＜0.05）。而與患者年齡、 雌激素受體 （ER）、 孕激素受體（PR）、Ki67、Her-2 表達、淋巴結分期（N）、遠處轉移（M）無顯著相關性，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。部分研究利用Cell Search 系統(tǒng)檢測乳腺癌外周血CTCs，結果表明CTCs 與患者年齡、激素受體狀態(tài)、Ki67 表達水平、病理類型、組織學分級以及原發(fā)腫瘤T 分期無明顯相關性[10，11]。本研究結果部分與其相一致。此外，研究表明[9，10]HER-2 陽性患者外周血CTCs 陽性率顯著高于HER-2 陰性患者。HER-2 狀態(tài)是唯一能夠可靠預測外周血CTCs 存在的原發(fā)腫瘤特征。與其相一致，本研究結果表明，HER-2 陽性組CTCs 陽性率為85.7%，HER-2 陰性組CTCs 陽性率為64.7%，HER-2 陽性組具有更高的陽性率。既往研究[12]利用RTPCR 檢測CTCs，結果表明CTCs 與淋巴結轉移、TNM 分期相關。亦有研究[13]利用實時熒光定量PCR 法檢測外周血CTCs，結果表明在腫塊直徑＞5cm、≥10 枚腋窩淋巴結轉移、TNM 分期為Ⅲ期、HER-2 陽性亞組中，可手術乳腺癌組外周血CTCs 陽性率更高。德國的一項針對3173 例乳腺癌患者的回顧性分析[14]結果顯示，CTC 陽性患者比CTC 陰性患者的腫瘤更大，差異具有統(tǒng)計學意義。與此結果相一致，我們的研究結果表明T3+T4亞組、TNM 分期為Ⅲ+Ⅳ期亞組CTCs 陽性率更高，差異具有統(tǒng)計學意義。N3 亞組呈現(xiàn)更高的CTCs 陽性率（100%，6/6）。

平均隨訪6年余，CTC 陽性組與CTC 陰性組在遠處轉移及死亡發(fā)生率方面差異無統(tǒng)計學意義。但是CTC 陽性組在隨訪期間發(fā)生遠處轉移及死亡例數(shù)明顯多于CTC 陰性組。2018年美國癌癥聯(lián)合委員會指南已將CTCs 列為乳腺癌預后評估工具，即乳腺癌患者外周血中存在CTCs 提示預后不良。本研究樣本量有限，尚需擴大樣本量進一步論證該結論。

本研究不足之處是，未充分考慮到CTCs 中上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的存在。EMT 是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間充質表型細胞的生物學過程，它能導致E-cadherin、EpCAM 等上皮標志物丟失，N-cadherin 過度表達以及細胞骨架改變（如波形蛋白表達），最終產生表型和結構改變，從而導致細胞運動性和侵襲性增強[15，16]。因此可能低估了CTCs 在某些病例中的陽性率，從而對統(tǒng)計學差異產生影響。我們將在后續(xù)研究中進一步完善。