山楊柱頭可授性及雌花枝質量對花芽發育影響

李靜　郭成博　李正華　白卉

摘 要：最佳授粉時期的判定是山楊定向育種工程實施的關鍵技術環節，可以指導山楊授粉雜交，提高育種效率。本研究以在山楊優良種源中選取的優良單株為實驗材料，采用柱頭形態學觀察，結合聯苯胺-過氧化氫試劑法對其可授性進行研究，同時對不同長度、直徑的雌花枝做保留不同葉芽和花芽數量處理、觀測，分析其花序長度、千粒質量等指標，探討花枝質量對花芽發育的影響。研究結果顯示，在溫室水培環境下，山楊雌蕊可授期持續3 d左右，雌蕊柱頭外部形態特征與可授時期有一定相關性，花序松散伸長，柱頭能夠全部探出芽鱗，開裂角度約180°，呈紅色且柱頭分泌出大量晶瑩透亮的黏液，聯苯胺-過氧化氫染色出現大量氣泡，柱頭為深藍色時是山楊最佳的授粉時期。柱頭完全露出，濕潤且分泌大量黏液的形態特征可以作為山楊雌蕊進入最佳可授期的標志信號，用來指導山楊雜交育種授粉。底端直徑2 cm左右、長度2 m的花枝保留2～3個花序，保留1對頂端葉芽時最有利于花芽和種子發育。

關鍵詞：山楊;最佳授粉時期;可授性

中圖分類號：S792.11;S722.3?? 文獻標識碼：A? 文章編號：1006-8023（2021）02-0011-07

Study on Stigma Receptivity and Effects of Female Flowering Branches

Quality on Flower Bud Development of Populus davidiana

LI Jing， GUO Chengbo， LI Zhenghua*， BAI Hui*

（Heilongjiang Forestry Institute， Harbin 150081， China）

Abstract：The determination of the optimum pollination period was the key technology in the implementation of Populus davidiana directive breeding project， which can guide the hybrid pollination of populus davidiana and improve the breeding efficiency. Choosing Populus davidiana single plants selected from superior provenances as the research object， the stigma receptivity and optimal pollination period of Populus davidiana were studied by testing benzidine-H2O2 method and morphological observations. At the same time， female flowering branches with different lengths and diameters were treated with different leaf buds and flower bud number to observe and analyze inflorescence length， 1 000-grain weight and other indexes， to explore the influence of female flowering branches quality on flower bud development. The results showed that under a greenhouse condition， the stigma of the optimal receptivity stage of Populus davidiana was 3 d. The external morphological characteristics of the pistil stigma had a certain correlation with the receptive period. The optimal pollination period of Populus davidiana was when the inflorescence was loose and elongated， the stigma could all protrude out of bud scales， the cracking angle was about 180° and the stigma was red and secreated a lot of crystal clear mucus， benzidine-H2O2 staining appeared a lot of bubbles， and the stigma changed to deep blue. The morphological characteristics of stigma fully exposed， moist and secreting a lot of mucus could be used as a signal of the optimal pollination period of Populus davidiana， which could be used to guide the cross breeding and pollination of Populus davidiana. There was the best for flower bud and seed development that flower shoot retain 2 to 3 inflorescences and retain the only one pair leaf bud at the top with the bottom diameter was 2 cm and length was 2 m.

Keywords：Populus davidiana; optimal pollination period; stigma receptivity

收稿日期：2020-11-04

基金項目：黑龍江省森工總局青年基金項目 （sgzjQ2016002）;國家林業和草原局林業科技發展項目（KJZXZF2019005）;黑龍江省省屬科研院所基本科研業務費專項（2012-04）

第一作者簡介：李靜，碩士，助理研究員。研究方向為楊樹倍性育種。E-mail： muerliji@163.com

通信作者：白卉，博士，研究員。研究方向為林木遺傳育種。E-mail： baihui1979@163.com

并列通信作者：李正華，碩士，副研究員。研究方向為細胞生物學。E-mail： 115491310@qq.com

引文格式：李靜，郭成博，李正華，等. 山楊柱頭可授性及雌花枝質量對花芽發育影響[J].森林工程，2021，37（2）：11-17.

LI J， GUO C B， LI Z H， et al. Study on stigma receptivity and effects of female flowering branches quality on flower bud development of Populus davidiana[J]. Forest Engineering，2021，37（2）：11-17.

0 引言

山楊（Populus davidiana ）屬于白楊派樹種，用途廣泛，適生范圍廣，主要分布于：20～55° N，100～135° E，垂直分布海拔為200～3 500 m，東北、華北、西北、華中乃至西南的眾多省區，全國 23 個省區分布的山楊總面積可達200萬hm2以上。其材質潔白、輕軟富彈性，結構、紋理和纖維素含量等指標較其他楊樹樹種優勢明顯，造紙時不加填充料，工藝簡單[1]，成品紙張品質極佳。但天然山楊林心腐嚴重，未經選育的山楊植株生長緩慢[2]。因此，山楊優良品種的選育對適生區人工林營建和高品質木材生產均具有重要意義[3]。傳統的選優、雜交等育種方式難以滿足現階段山楊遺傳改良需求，多倍體育種能最大幅度綜合雜種優勢和倍性優勢，發揮其在林木遺傳改良作用，這是山楊良種培育行之有效的捷徑[4-6]。

植物雌蕊柱頭的可授期代表柱頭發育的一個階段，并不僅僅局限于特定的時間點，短則幾小時，長則十幾天。植物最佳授粉時間的準確判定是保證雜交成功的關鍵因素之一。通過植物柱頭可授性的研究，明確雌蕊柱頭的最佳授粉時期，不僅可以減少授粉工作量，而且還可以大大提高雜交的成功率。在育種工作方面已有通過可授期研究提高雜交效率的報道[7]。雌蕊柱頭可授性的檢測方法很多，其中定期授粉觀察花粉萌發較準確，可靠程度高，但需要的時間相對較長。當植物雌蕊柱頭具有可授性時，柱頭表面往往伴隨著高度的酶活性，目前已發現一些酶和蛋白的存在與柱頭可授性的獲得，與喪失變化相一致，基于柱頭酶活性鑒定而建立的聯苯胺-過氧化氫法應運而生，現已廣泛應用于楊樹、油棕、木槿和風箱果等多種植物柱頭可授期和最佳授粉期檢測[8-10]。雌蕊柱頭可授期以及最佳授粉時期的明確可以減少工作量，精準指導雜交，提高育種效率和雜交成功率，進而提高綜合雜交和多倍體優勢的誘變育種中突變體獲得比率，構建高質量、大基數的品種選育群體，成功實現纖維用材林的育種目標，是山楊定向育種工程實施的關鍵技術環節。大多數生殖期山楊優良種源的株高較高使得取材不便，為了更好地利用優良資源，本研究對不同規格雌花枝做不同處理后對花芽長度、千粒質量等進行觀測分析，探討花枝質量對花芽發育的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究使用的山楊植株取于牡丹江林口縣青山林場內山楊優良種質資源保存林。

1.2 試驗方法

1.2.1 花枝的采集

2月下旬選擇雌雄株優樹，采集樹冠中上部、向陽面和花芽發育飽滿的枝條，花枝直徑為0.5、1、1.5 cm，長度為1、1.5、2 m，采集的花枝用塑料膜包裹嚴密，在-5～3 ℃低溫中貯藏備用。

1.2.2 花枝質量對花芽發育影響正交實驗設計

為探討花枝質量對花芽發育影響，以花枝長度、花枝下端直徑、葉芽保留數量和花芽保留數量為因素，做了四因素三水平正交實驗設計（L934），統計授粉期花芽長度和千粒質量衡量花芽發育質量以及種子質量，每組實驗3次重復，見表1。

1.2.3 雌花枝的培養

低溫貯藏的雌花枝水培前需預處理，將長勢差、過密和徒長無花芽的枝條修剪掉，2～3 d換一次水。溫室水培時溫度保持在白天20～25 ℃，夜晚10～15 ℃。

用于可授性試驗的花枝根據最利于花芽發育的組合進行處理。

1.2.4 雄花枝的培養和花粉的采集

水培前需與雌花枝一樣整枝，具體做法和水培條件參照1.2.3。雄花枝比雌花枝提早一周水培，水培后勤觀察，及時收粉，用硫酸紙做成漏斗，輕抖小枝，動作輕柔將花粉收集到玻璃小瓶中，在瓶中加入變色硅膠干燥劑，4 ℃冰箱低溫冷藏備用。

1.2.5 雌蕊的觀測

3月中旬，將雌花枝置于溫室內水培，從水培第2天開始，每隔6 h采集雌蕊中上部柱頭，用鑷子取下，隨取隨測，每次檢測5朵花，試驗重復3次。

雌蕊柱頭外部形態變化用體式顯微鏡（SMZ-140n2gg）觀察并拍照記錄。

可授性檢測采用李艷華等[11]和王君等[12]的聯苯胺-過氧化氫法。反應液現配現用，在體視顯微鏡下觀察氣泡產生情況以及柱頭變色情況，若柱頭周圍變為藍色并有氣泡產生，則記為柱頭具有可授性，若柱頭周圍變為深藍色并迅速產生大量氣泡，則記為柱頭為最佳可授期。

1.3 數據處理與分析

本試驗數據用Excel 10.0進行表格統計記錄，用SPSS 19.0進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 花枝質量對花芽和種子發育影響

正交試驗結果見表2。

利用正交設計對試驗結果均值進行直觀分析，結果見表3。極差R反映了影響因素對花序長度的影響，R值越大，影響越顯著。由表3可知，該試驗水平內各因素水平的變化對花序長度的影響由大到小依次為：花枝下端直徑、花枝長度、葉芽保留數量、花芽保留數量。

每一因素水平下的均值反映了影響因素各水平對花序長度的影響情況，均值越大，反應水平越好。從表 3可以看出，4個影響因素的最佳組合并沒有在正交表中出現，用SPSS軟件對試驗結果進行方差分析及多重比較，結果表明各因素的影響由大到小依次為：花枝下端直徑、花枝長度、葉芽保留數量、花芽保留數量，該結果與極差分析相一致（表4）。經多重比較可知，花序長度在A3水平，即花枝長度為2 m時最長，與其他2個水平的差異顯著;花枝下端直徑B3水平，即1.5 cm最佳;葉芽保留數量C3水平，即僅頂端保留1對最佳;花芽保留數量D3水平最好，即保留2～3個最好，但水平2和水平3之間差異不顯著。根據各水平的多重比較，得出影響花序長度的最佳組合：A3B3C3D3，即花枝長度為2 m，花枝下端直徑為1.5 cm，葉芽保留數量為僅頂端保留1對，花芽保留數量為2～3。

從表3可知4個影響因子對千粒質量的直觀分析結果表明，各因素水平的變化對千粒質量的影響由大到小依次為：花枝長度、花枝下端直徑、花芽保留數量、葉芽保留數量。方差分析及多重比較結果見表5。SPSS分析結果與直觀分析結果一致。經多重比較可知，千粒質量在A3水平，即花枝長度為2 m時最大，且與其他兩個水平的差異顯著;花枝下端直徑B3水平，即1.5 cm最佳;葉芽保留數量C3水平，即僅頂端保留1對最佳，但水平2和水平3之間差異不顯著;花芽保留數量D3水平最好，即保留2～3個最好，且水平2和水平3之間差異不顯著。根據各水平的多重比較，得出影響千粒質量的最佳組合：A3B3C3D3，即花枝長度為2 m，花枝下端直徑為1.5 cm，葉芽保留數量為僅頂端保留1對，花芽保留數量為2～3個。不同長度、直徑的雌花枝保留葉芽和花芽數量的不同能夠影響了花序長度、千粒質量等指標。

2.2 雌蕊柱頭可授性及最佳授粉期判定

山楊雌蕊柱頭可授性和最佳授粉期的判定是提高雜交效率、保證雜交質量的有效途徑。相關研究以證明聯苯胺-過氧化氫法是檢測楊樹可授性的有效方式[13-16]。

本實驗結果表明，山楊在溫室水培條件下雌蕊可授期持續3 d左右，雌蕊柱頭形態特征與可授性和最佳可授時期存在一定程度相關性。從表6可以看出，水培至186 h，花序緊密，柱頭緊密連接、未展開，且光滑無黏液附著，顏色呈淺紅色，經試劑反應液測試未產生氣泡，顏色無變化，此階段雌蕊為非可授期;水培至192 h，花序伸長微露柱頭，柱頭裂開角度小于30°，表面分泌有少量黏液，顏色呈紅色，經試劑反應液測試仍未產生氣泡，顏色無變化。水培至204 h，花序繼續伸長露出柱頭，柱頭開裂角度大于60°，表面均勻分布著一層黏液，柱頭顏色仍為紅色，經試劑反應液測試產生少量氣泡，柱頭顯色為藍色，標志著山楊雌蕊柱頭具有可授性，雌花進入可授期。水培至216 h，花序松散，柱頭完全露出，柱頭開裂角度加大至180°，此時肉眼即可觀測到雌花柱頭瑩潤透亮，伴有大量黏液分泌，放入反應液檢測時柱頭迅速產生大量氣泡，柱頭染色變為深藍色，此時可授性最強，進入最佳授粉期。繼續溫室水培至276 h，花序伸長至最長，柱頭顏色變暗淡呈紅褐色，干燥無黏液并有萎蔫的趨勢，經試劑反應液測試不再有氣泡產生，此階段雌花序已經失去活力，不再具可授性。如圖1和圖2所示。

3 結論與討論

不同長度、直徑的雌花枝保留葉芽和花芽數量的不同直接影響了花序長度、千粒質量等指標。通過這2個指標初步探究了花枝質量對花芽發育的影響，長度越長、底端直徑越粗的花枝，保留2～3個花序，頂端保留1對葉芽時最有利于花芽和種子發育。在試驗過程中保留全部花芽的枝條，花芽發育到一定階段就停止生長進而萎蔫脫落，花序量大并沒有實現種子量大，而且結出的部分種子干癟，活力差。育種實踐中花序長度達到一定程度代表著花序發育情況好，更有利于結種，而千粒質量大的種子發育一般情況下也比質量小的更有優勢。僅保留1對頂端葉芽滿足植物蒸騰拉力，維持養分運輸，又不過多消耗養分利于水培枝條發育與試驗結果吻合。實驗結果表明，長度2 m、底端直徑2 cm的花枝，保留2～3個花序和1對頂端葉芽時最有利于花芽和種子發育。但考慮到野外取樣時長度太長不便于運輸，可結合實際情況考慮花枝縮短長度至1.5 m。

雌蕊柱頭是雌蕊頂端接受花粉的部位，其表面形態和生理特征影響著花粉的粘附[17-20]，山楊柱頭依靠分泌出的一定數量的黏液來獲取空氣中飛揚的花粉完成自然授粉過程，屬于風媒授粉，這是自然演化的結果[21]。實驗結果顯示，山楊雌蕊柱頭可授性與柱頭發育及其形態變化具有密切聯系，通過對柱頭形態的觀測對其可授性進行估測具有可行性，當花序松散，柱頭完全露出，晶瑩透亮、濕潤、均勻分布有大量黏液的形態特征可以作為山楊雌蕊進入可授期的標志信號，更簡便快捷的指導山楊授粉，而聯苯胺-過氧化氫試劑柱頭染色深藍色，迅速出現大量氣泡的時期為山楊最佳的授粉時期，可以更加精準指導雜交，提高育種效率和雜交成功率。

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