咪唑乙煙酸對黏質(zhì)沙雷氏菌酶活性的影響

李唯一　于凱悅　劉宇航　董愛榮　劉君旭

摘 要：為探究黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）降解咪唑乙煙酸有關的酶，用靛酚藍比色法、3.5-二硝基水楊酸（DNS）比色法、高錳酸鉀滴定法和鄰苯三酚比色法分別檢測黏質(zhì)沙雷氏菌培養(yǎng)液中脲酶、蔗糖酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶和纖維素酶的酶活性，以不加咪唑乙煙酸的純培養(yǎng)液作為對照。結(jié)果表明：以咪唑乙煙酸為唯一碳源培養(yǎng)的黏質(zhì)沙雷氏菌，脲酶活性培養(yǎng)初期時最高，然后逐漸下降，最后趨于平衡;蔗糖酶活性隨培養(yǎng)時間緩慢上升;過氧化氫酶活性呈上升—下降—上升—下降的趨勢;多酚氧化酶活性培養(yǎng)初期時活性最高，后一直呈下降趨勢，72 h后急劇下降至最低水平;纖維素酶活性先下降后上升，培養(yǎng)結(jié)束時恢復至初期水平。通過相關性分析得知，咪唑乙煙酸降解率與脲酶活性呈高度負相關關系，與蔗糖酶活性呈高度正相關關系。

關鍵詞：咪唑乙煙酸;黏質(zhì)沙雷氏菌;酶活性;降解率

中圖分類號：S154.2;S481;S565.1?? 文獻標識碼：A? 文章編號：1006-8023（2021）02-0018-05

Effect of Imazethapyr on the Enzyme Activity of Serratia marcescens

LI Weiyi1， YU Kaiyue1， LIU Yuhang1， DONG Airong1*， LIU Junxu2

（1.School of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China;

2.Qingdao Institute of Termite Control， Qingdao 266012， China）

Abstract：In order to explore the enzymes related to the degradation of imazethapyr by Serratia marcescens， the enzyme activities of urease， sucrase， catalase， polyphenol oxidase and cellulase in the culture medium of Serratia marcescens were detected by indophenol blue colorimetry， 3.5-dinitrosalicylic acid （DNS） colorimetry， potassium permanganate titration and pyrogallol colorimetry， respectively. The pure culture medium without imazethapyr was used as control. The results showed that the urease activity of Serratia marcescens cultured with imazethapyr as the sole carbon source was the highest at the initial stage of culture， gradually decreased， and then tended to balance， and the sucrase activity increased slowly with the culture time. The activity of catalase showed a trend of increased-decreased-increased-decreased. The activity of polyphenol oxidase was the highest at the beginning of culture， and then decreased sharply to the lowest level after 72 hours. The cellulase activity decreased at first and then increased， and returned to the initial level at the end of culture. Through correlation analysis， it was found that the degradation rate of imazethapyr was highly negatively correlated with urease activity， highly correlated with sucrase activity.

Keywords：Imazethapyr; Serratia marcescens; enzyme activity; degradation rate

收稿日期：2020-09-30

基金項目：國家自然科學基金項目（31670494）

第一作者簡介：李唯一，碩士研究生。研究方向為森林病理學。E-mail： 921376776@qq.com

通信作者：董愛榮，博士，副教授。研究方向為森林病理學。E-mail： darlmy@163.com

引文格式：李唯一，于凱悅，劉宇航，等.咪唑乙煙酸對黏質(zhì)沙雷氏菌酶活性的影響[J].森林工程，2021，37（2）：18-23.

LI W Y， YU K Y， LIU Y H， et al. Effect of imazethapyr on the enzyme activity of Serratia Marcescens[J]. Forest Engineering，2021，37（2）：18-23.

0 引言

咪唑乙煙酸是一種咪唑啉酮類除草劑，與其他常用除草劑相比，具有殺草譜廣、除草效果好、成本低、苗前苗后都可用、活性高和用量低等優(yōu)點，在我國被廣泛使用[1]。例如，咪唑乙煙酸能有效提高苜蓿產(chǎn)量、降低雜草種類[2-3]。目前黑龍江省主要使用于單季大豆田[4]。農(nóng)藥的大量使用會對生態(tài)環(huán)境造成破壞，并且農(nóng)藥的殘留也將危害人畜的健康[5]。

微生物是農(nóng)藥轉(zhuǎn)化降解的重要因素之一。研究表明，微生物主要是通過酶促反應對農(nóng)藥起作用[6]。黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）是一種在自然界中廣泛存在的兼性厭氧菌，是水和土壤的常居菌群，同時也是一種應用前景非常廣闊的微生物[7]。例如，黏質(zhì)沙雷氏菌能分泌高活性的幾丁質(zhì)酶，具有殺菌殺蟲作用，可用于防治植物病蟲害[8]。黏質(zhì)沙雷氏菌對亞洲柑橘木虱（Diaphorina citri）若蟲有較高的殺蟲活性，其發(fā)酵的上清液也可導致亞洲柑橘木虱若蟲死亡[9]。黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)生的脂肪酶可廣泛應用于食品、制藥以及生物能源等領域[10]。從黏質(zhì)沙雷氏菌細胞壁提取的靈桿菌脂多糖可以抗腫瘤[11]。黏質(zhì)沙雷氏菌作為一種生防菌，對連作土壤具有修復作用[12]。此外，黏質(zhì)沙雷氏菌還可以降解油脂[13]。

自然條件下，咪唑乙煙酸的降解不是以單一的方式進行，它可以在多種不同酶作用下以不同的方式進行[14]。酶具有專一性，而能降解同一類底物的酶通常具有相似的性質(zhì)。脲酶是一種催化尿素水解成氨和二氧化碳的酶。蔗糖酶不僅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。過氧化氫酶能催化過氧化氫分解成氧和水。多酚氧化酶是一類含銅的氧化還原酶，能催化鄰苯二酚氧化成鄰苯二醌，也能作用于單酚單加氧酶的底物。纖維素酶能在分解纖維素時起生物催化作用，是可以將纖維素分解成寡糖或單糖的蛋白質(zhì)。本文通過測定咪唑乙煙酸對黏質(zhì)沙雷氏菌生化酶活性的影響，探尋與降解咪唑乙煙酸相關酶系，為咪唑乙煙酸及其他咪唑啉酮類除草劑的生物酶降解提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）為課題組前期馴化得到的高效降解菌株。菌株富集培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。其他實驗采用無機鹽培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

將黏質(zhì)沙雷氏菌接種于盛有100 mL的富集培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于28 ℃、160 r/min的搖床上培養(yǎng)2 d。取10 mL培養(yǎng)液加入盛有90 mL質(zhì)量分數(shù)為100 mg/kg的咪唑乙煙酸的無機鹽培養(yǎng)基中，其中咪唑乙煙酸為唯一碳源，對照組為加10 mL的無機鹽培養(yǎng)基，均置于25 ℃、160 r/min的搖床上培養(yǎng)4 d，從中取12、24、48、72、96 h的菌液，12 000 r/min離心10 min，取上清液即為粗酶液，測定各培養(yǎng)時間的酶活性和降解率。

1.3 酶活性測定

脲酶活性測定采用靛酚藍比色法[15]。蔗糖酶活性測定采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法[16]。過氧化氫酶活性測定采用高錳酸鉀滴定法[17]。多酚氧化酶活性測定采用鄰苯三酚比色法[18]。纖維素酶活性測定采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法[19]。

1.4 降解率的測定

參照靳穎華[20]的方法，采用液相色譜法測定咪唑乙煙酸降解率。采用Waters2695液相色譜儀與Waters2996紫外檢測器（上海力明生物科技有限公司），流動相：VA液為0.05%冰乙酸乙腈，VB液為0.4%冰乙酸水溶液，VA與VB體積比為40∶60;分離分析柱為Agilent ZORBAX Extend-C18柱（250 mm，4.6 mm，5μm）;進樣條件：柱溫室溫，進樣量10 μL，檢測波長254 nm。

咪唑乙煙酸降解率= [（CK殘留質(zhì)量分數(shù)-加培養(yǎng)液殘留質(zhì)量分數(shù)）/CK殘留質(zhì)量分數(shù)]×100%。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)整理計算和作圖采用Excel 2010，相關性分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件（IBM公司）。

2 結(jié)果與分析

2.1 咪唑乙煙酸對黏質(zhì)沙雷氏菌脲酶活性影響

對照組（CK）為黏質(zhì)沙雷氏菌的純培養(yǎng)液，實驗組（N）為加入咪唑乙煙酸的黏質(zhì)沙雷氏菌培養(yǎng)液。培養(yǎng)初期，實驗組（N）脲酶活性遠低于對照組（CK），說明咪唑乙煙酸抑制了黏質(zhì)沙雷氏菌分泌脲酶。24 h時，兩組脲酶活性均降低，對照組（CK）脲酶活性最低值達0.423 μg/（min·mL），之后兩組脲酶活性都逐漸趨于水平，差異性不大（圖1）。

2.2 咪唑乙煙酸對黏質(zhì)沙雷氏菌蔗糖酶活性影響

對照組（CK）為黏質(zhì)沙雷氏菌的純培養(yǎng)液，實驗組（N）為加入咪唑乙煙酸的黏質(zhì)沙雷氏菌培養(yǎng)液。實驗組（N）蔗糖酶活性呈緩慢上升的趨勢，而對照組（CK）蔗糖酶活性是先降低后升高。培養(yǎng)12 h時，兩組蔗糖酶活性基本相同。之后加入咪唑乙煙酸的實驗組（N）蔗糖酶活性開始緩慢上升，直到培養(yǎng)結(jié)束。對照組（CK）蔗糖酶活性在培養(yǎng)24 h時有所下降，達到最低值807.23 μg/（min·g），之后逐漸上升并趨于平穩(wěn)（圖2）。

2.3 咪唑乙煙酸對黏質(zhì)沙雷氏菌過氧化氫酶活性影響

對照組（CK）為黏質(zhì)沙雷氏菌的純培養(yǎng)液，實驗組（N）為加入咪唑乙煙酸的黏質(zhì)沙雷氏菌培養(yǎng)液。加入咪唑乙煙酸的實驗組（N）和未加咪唑乙煙酸的對照組（CK）過氧化氫酶活性的變化趨勢大致相同，呈上升—下降—上升—下降的趨勢。培養(yǎng)12 h時，兩組過氧化氫酶活性最低。培養(yǎng)24 h時，兩組過氧化氫酶活性均升高，而對照組（CK）的過氧化氫酶活性高于實驗組（N）。這可能是因為黏質(zhì)沙雷氏菌的數(shù)量增加，活性增強，促進了過氧化氫酶的分泌。培養(yǎng)48 h時，實驗組（N）過氧化氫酶活性有所下降，對照組（CK）過氧化氫酶活性顯著降低。培養(yǎng)72 h時，兩組過氧化氫酶活性又開始上升，均恢復至24 h時的水平。之后又開始下降，直到培養(yǎng)結(jié)束（圖3）。

2.4 咪唑乙煙酸對黏質(zhì)沙雷氏菌多酚氧化酶活性影響

對照組（CK）為黏質(zhì)沙雷氏菌的純培養(yǎng)液，實驗組（N）為加入咪唑乙煙酸的黏質(zhì)沙雷氏菌培養(yǎng)液。在培養(yǎng)期間，兩組多酚氧化酶活性的變化趨勢大致相同。培養(yǎng)12 h時，兩組多酚氧化酶活性相差不多。培養(yǎng)24 h時，兩組多酚氧化酶活性均開始下降，可能是因為咪唑乙煙酸抑制了黏質(zhì)沙雷氏菌分泌多酚氧化酶，但實驗組（N）比對照組（CK）高3.6 U/mL。之后48 h和72 h時的多酚氧化酶活性變化不大，72 h之后兩組多酚氧化酶活性均急速下降，直到培養(yǎng)結(jié)束（圖4）。

2.5 咪唑乙煙酸對黏質(zhì)沙雷氏菌纖維素酶活性影響

對照組（CK）為黏質(zhì)沙雷氏菌的純培養(yǎng)液，實驗組（N）為加入咪唑乙煙酸的黏質(zhì)沙雷氏菌培養(yǎng)液。在培養(yǎng)初期，兩組纖維素酶活性的變化趨勢相同，纖維素酶活性均有所升高。從24 h開始，加入咪唑乙煙酸的實驗組（N）與不加咪唑乙煙酸的對照組（CK）的變化趨勢在各個時期均相反。培養(yǎng)48 h時，對照組（CK）纖維素酶活性達到最高值47.91 μg/（min·mL），而實驗組（N）纖維素酶活性顯著降低，達到最低值8.74 μg/（min·mL）。培養(yǎng)72 h時，對照組（CK）纖維素酶活性為最低值36.73 μg/（min·mL），而實驗組（N）則顯著升高（圖5）。

黏質(zhì)沙雷氏菌各酶活性各時間點對照組和實驗組顯著性差異分析情況見表1。

2.6 黏質(zhì)沙雷氏菌對咪唑乙煙酸的降解率

黏質(zhì)沙雷氏菌對咪唑乙煙酸的降解率趨勢如圖6所示，在96 h內(nèi)，隨著時間的增長，咪唑乙煙酸的降解率逐漸增加，48 h后達到86.45%，之后緩慢增長，直至92.33%。

2.7 黏質(zhì)沙雷氏菌液中各酶活性與降解率相關性分析

通過SPSS 軟件對不同培養(yǎng)時期的黏質(zhì)沙雷氏菌的各種酶活性數(shù)據(jù)與對應時期的咪唑乙煙酸降解率進行相關性分析，結(jié)果見表2。以咪唑乙煙酸為唯一碳源培養(yǎng)黏質(zhì)沙雷氏菌，咪唑乙煙酸的降解率與脲酶活性呈高度負相關;與蔗糖酶活性呈高度正相關，與過氧化氫酶、多酚氧化酶和纖維素酶活性相關性不顯著。

3 結(jié)論與討論

利用本身對農(nóng)藥有降解作用的酶系基因，微生物會將農(nóng)藥直接作為唯一碳源和能源，分解成諸多分子量小的化合物[21]。以咪唑乙煙酸為唯一碳源培養(yǎng)黏質(zhì)沙雷氏菌，所選擇的5種酶活性均有變化，說明咪唑乙煙酸的降解跟這5種酶均有一定的關系。脲酶活性在培養(yǎng)初期最高，24 h急劇下降，然后趨于平衡;蔗糖酶活性呈緩慢上升;過氧化氫酶活性呈上升—下降—上升—下降的趨勢;多酚氧化酶活性培養(yǎng)初期時活性最高，后一直呈下降趨勢，直至下降至最低水平;纖維素酶活性先下降后上升，培養(yǎng)結(jié)束時恢復至初期水平，變化趨勢與對照組相反。

目前研究發(fā)現(xiàn)，能夠降解咪唑啉酮類除草劑的微生物主要為土壤中的細菌，包括酸單胞桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、芽孢桿菌屬、海球菌屬、節(jié)細菌屬、丙酸桿菌屬和無色桿菌等，還有黑曲霉和放線菌[22]。本文通過對黏質(zhì)沙雷氏菌各酶活性與降解率之間的相關性分析，發(fā)現(xiàn)咪唑乙煙酸的降解率與脲酶活性呈高度負相關，與蔗糖酶活性呈高度正相關，與過氧化氫酶、多酚氧化酶和纖維素酶活性相關性不顯著，這與李德斌[23]的研究結(jié)果一致。同時進一步說明了脲酶和蔗糖酶在咪唑乙煙酸的降解中起到了較大的作用，為后續(xù)黏質(zhì)沙雷氏菌降解農(nóng)藥除草劑提供了理論基礎。

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