響應面優化滇黃精多糖提取及其結構與活性分析

梁朋光 孫健 岳健 蘇娟 唐雅園 欒會燕 邱福榮 楊兆杏 向昱 何雪梅

摘要：【目的】通過優化動態超高壓微射流法對滇黃精多糖提取的相關工藝條件，分析其結構與活性，為滇黃精多糖的多元化利用提供技術支持?！痉椒ā恳缘狳S精多糖得率為考察指標，在單因素試驗的基礎上設計響應面法分析試驗，確定動態超高壓微射流法提取滇黃精多糖的最佳條件;并對滇黃精多糖的功能活性（酪氨酸酶抑制活性、α-糖苷酶抑制活性及DPPH自由基清除能力等）與結構特性（紅外光譜、相對分子量及單糖組成等）進行研究。【結果】經響應面分析構建滇黃精多糖得率的二次回歸方程：Y=19.55+0.7A+0.78B+0.89C+0.28AB+1.26AC+0.84BC-1.84A2-4.72B2-2.3C2（R2=0.9860）（Y表示滇黃精多糖得率，A、B、C分別表示微射流壓力、料液比和提取時間），提取時間、料液比及微射流壓力與提取時間的交互作用對滇黃精多糖得率有極顯著影響（P<0.01），微射流壓力及提取時間與料液比的交互作用對滇黃精多糖得率有顯著影響（P<0.05），3個因素對多糖得率影響的排序為：提取時間>料液比>微射流壓力;滇黃精多糖的最佳提取工藝條件為：微射流壓力146 MPa、料液比1∶41、于100 ℃下提取70 min，在此條件下，滇黃精多糖得率為19.57%，達理論預測值的98.69%。滇黃精多糖是一種由11種單糖組成的吡喃型酸性多糖，相對分子量為35.95 kD，具有較強的DPPH自由基清除能力、α-葡萄糖苷酶抑制活性和酪氨酸酶抑制活性，半抑制質量濃度（IC50）分別為0.43、4.07和2.87 mg/mL?！窘Y論】采用響應面法優化動態超高壓微射流法提取滇黃精多糖的得率高，預測性良好，滇黃精多糖具有良好的功能活性，有廣泛的開發前景。

關鍵詞： 滇黃精多糖;響應面分析;動態超高壓微射流;提取工藝;結構;活性

中圖分類號： S567.219? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）12-3434-12

Response surface optimization of extraction and structure and activity analysis of polysaccharides from Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.

LIANG Peng-guang1， SUN Jian2， YUE Jian3， SU Juan3， TANG Ya-yuan2， LUAN Hui-yan1，Khoo Hock Eng3， YANG Zhao-xing2，XIANG Yu2， HE Xue-mei2*

（1Yantai Gold Vocational College，Yantai，Shandong? 264000， China; 2Agro-food Science and Technology Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Guangxi Key Laboratory of Fruits and Vegetables Storage-processing Technology， Nanning? 530007， China; 3Yunnan Shanlihong Biotechnology Co.， Ltd.，Kunming? 650200， China）

Abstract：【Objective】The extraction of polysaccharides from Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.（PKP） by dynamic high-pressure microfluidization（DHPM） were optimized and its structure and activity were analyzed， which provide technical support for the diversified utilization of PKP. 【Method】Response surface methodology （RSM） was designed on the basis of single factor experiment to determine the optimal extraction conditions of PKP to determine the optimal extraction conditions by DHPM，with PKP yield as the indicators. The activities （tyrosinase inhibitory activity， α-glycosidase inhibitory activity， DPPH radical scavenging activity） and structural characteristics （infra-red spectrum， relative molecular weight， monosaccharide composition） of PKP were studied. 【Result】The quadratic regression equation established by RSM and the model had good fitting degree，as follow：Y=19.55+0.7A+0.78B+0.89C+0.28AB+1.26AC+0.84BC-1.84A2-4.72B2-2.3C2（R2=0.9860）（Y was extraction yield，A was microfluidization pressure，B was material-liquid ratio and C was extraction time）. Influence of extraction time，material-liquid ratio and interaction of microfluidization pressure and extraction time to PKP yield were extremely significant（P<0.01）. Influence of microfluidization pressure and interaction of material-liquid ratio and extraction time to polysaccharides yield were and significant（P<0.05）. Parameters influencing PKP yield were in the order as follows：extraction time>material-liquid ratio>microfluidization pressure. The optimal parameters were microfluidization pressure of 146 MPa， material-liquid ratio of 1∶41， extracting time of 70 min at 100 ℃. Then the polysaccharides yield was 19.57%， and 98.69% of the theoretical prediction was obtained. PKP was an acidic polysaccharide composed of 11 monosaccharides with a relative molecular weight of 35.95 kD. PKP showed strong DPPH radical scavenging ability， α-glycosidase inhibitory activity and tyrosinase inhibitory activity. The semi-suppressed mass concentration（IC50） were 0.43， 4.07 and 2.87 mg/mL respectively. 【Conclusion】 RSM is suitable for optimize the extraction parameters of PKP by DHPM. The yield of PKP obtained by this method is high and has good predictive performance. PKP has good functional activities and wide development prospect.

Key words： Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl. polysaccharides; response surface methodology; dynamic high-pressure microfluidization; extraction technique; structure; activity

Foundation item：Yunnan Scientific Research Talents and Platform Project（2019IC054）;Guangxi Scientific Base and Talents Project（Guike AD19110141）; Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricultural Sciences（Guinongke 2021 YT112， Guinongke 2021YTI16）

0 引言

【研究意義】作為我國藥典收錄的三大黃精品種之一，滇黃精（Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.）是一種傳統的藥食兩用藥材，其功效包括益氣補脾與潤肺滋腎（國家藥典委員會，2015;肖韻錚等，2020）。多糖是滇黃精的主要功效成分之一，現代藥理學證明其具有抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、增強免疫力、降血脂以及降血糖等活性，目前已在食品、保健品、藥品及化妝品領域中得到了較多的應用（Debnath et al.，2013;衡銀雪等，2017;吳其國等，2018;Li et al.，2018;Tang et al.，2019）。多糖生物活性與化學結構緊密相關，而多糖的化學結構很大程度上受提取方式影響（陳燦輝等，2019;葉興乾等，2019），提取方法的差異導致細胞壁中釋放出不同成分，因此其多糖化學結構會有所不同（Broxterman and Schols，2018）。多糖的提取是滇黃精多糖應用的基礎，適宜的提取技術對滇黃精開發利用起到至關重要的作用，研究特定提取方式下多糖的化學結構和主要生物活性對其應用也具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】在提取黃精多糖方面，常用的技術包括酶解提取法、酸堿提取法及熱水浸提法等。趙瑞萌等（2010）研究發現采用堿提法可提高黃精多糖提取率，獲得提取率為11.89%;宮江寧等（2019）采用水提醇沉法提取黃精多糖并優化其提取參數，黃精多糖得率可達（7.96±0.12）%;張梓原等（2020）比較水提醇沉法和復合酶解法對黃精多糖的提取效果，結果發現復合酶解法得到的多糖得率（22%）遠高于水提醇沉法得到的多糖得率（8.84%），且提取溫度較低;唐蘭芳等（2021）改進提取溶劑，采用低共熔溶劑提取黃精多糖，所得多糖提取率是熱水提取的3.40倍，多糖分子質量顯著大于熱水提取所得的多糖，單糖組成更復雜，多糖的抗氧化與抗糖基化能力顯著強于熱水提取法。近年的研究結果顯示，若在提取前進行適當的破壁處理，將會有助于多糖得率的進一步提升，因此研究者們基于常規的提取方法，發展了一些更高效的提取技術，包括高壓輔助提取技術、閃式提取技術、微波輔助提取技術和超聲波輔助提取技術等，同時還有結合多種方法的復合提取技術，這些方法各具優勢。粟敏等（2016）將離子液體—微波輔助用于提取多花黃精多糖，提取125 s下獲得提取率為12.79%;魏煒等（2019）采用響應面法優化超高壓提取滇黃精多糖的工藝條件，在壓力255 MPa下提取9.5 min，多糖提取率為25.01%，遠高于熱水浸提的提取率;于偉凱等（2020）采用微波輔助提取泰山黃精多糖，提取時間縮短至2 min;劉日斌等（2021）利用超聲輔助酶法提取黃精多糖，提取率達25.63%。可見破壁前處理輔助新型提取技術在提取效率和得率方面表現出巨大優勢?！颈狙芯壳腥朦c】動態超高壓微射流（DHPM）已應用于多糖的提取和改性領域，其主要原理是利用瞬間的壓力釋放、強烈剪切及高速碰撞等相關作用，使細胞壁發生破裂，提升傳質速度，利于多糖提取率的進一步提升;此外，可將多糖分子鏈條剪斷，使分子聚集狀態、微粒粒度及單糖組成等有所改變，從而改變多糖的空間結構及分子內與分子間作用力（姜穎等，2010;李亞楠等，2015）。秦令祥等（2019）通過動態超高壓微射流技術提取黑木耳多糖，結果發現其比熱水浸提、超聲波輔助和微波輔助提取法的提取效率高，同時所提取多糖的抗氧化活性有明顯提高。可見，動態超高壓微射流技術可實現多糖的高效率提取，但目前采用其進行滇黃精多糖提取，并研究多糖活性與結構的文獻報道較少。【擬解決的關鍵問題】通過響應面法對動態超高壓微射流輔助提取滇黃精多糖工藝進行優化，并探討其對滇黃精多糖生物活性、理化性質及結構的影響規律與內在機理，為滇黃精多糖的開發與應用提供技術支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

滇黃精原料采自云南普洱（2020年1月），將其清洗干凈后切片，在50 ℃下烘干，粉碎過篩（60目）備用。主要試劑：阿卡波糖（拜耳醫藥保健有限公司）;單糖標準品、葡聚糖標準品、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、α-葡萄糖苷酶、酪氨酸酶（美國Sigma公司）;熊果苷[珠峰貿易（廣州）有限公司];1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、對硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（PNPG）（北京索萊寶科技有限公司）。主要儀器設備：Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）、 M-110EH型微射流均質機（美國Microfluidics公司）、傅里葉變換紅外光譜儀FT-IR650（天津港東科技發展股份有限公司）、GYB40-10S小型均質機（上海東華高壓均質機廠）、HAAKE Mars-III旋轉流變儀（德國賽默飛世爾公司）、752N紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）、RE-52AA旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）、SHZ-82水浴恒溫振蕩器（江蘇省金壇市恒豐儀器廠）、101-3電熱鼓風恒溫干燥箱（上海浦東榮豐科學儀器有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 動態超高壓微射流法提取滇黃精多糖 在秦令祥等（2019）的方法上進行部分改進。稱量滇黃精粉末（含水量9.83%）5 g，按試驗設定比例分散于蒸餾水中，通過均質機進行5 min均質處理（壓力設定為30 MPa），按試驗設計的壓力參數進行微射流均質后熱水浸提，所得多糖提取液在5000 r/min條件下離心10 min，取上清液在60 ℃下減壓濃縮后醇沉，醇沉后的樣品進行離心處理（5000 r/min、10 min），冷凍干燥得到滇黃精多糖（Polysaccharides from Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.，簡稱PKP）。

1. 2. 2 多糖含量測定 采用苯酚—硫酸法測定，按照公式（1）計算多糖得率：

多糖得率（%）=提取所得多糖質量/原料質量×

100? （1）

1. 2. 3 單因素試驗設計

1. 2. 3. 1 微射流壓力對滇黃精多糖得率的影響

固定其他提取參數為微射流處理次數1次、提取時間1.0 h、提取溫度100 ℃、料液比1∶40（g/mL，下同），在此條件下考察不同微射流壓力（80、100、120、140、160和180 MPa）對滇黃精多糖得率的影響。

1. 2. 3. 2 微射流處理次數對滇黃精多糖得率的影響 固定其他提取參數為微射流壓力140 MPa、提取時間1.0 h、提取溫度100 ℃、料液比1∶40，在此條件下考察不同微射流處理次數（1、2、3、4和5次）對滇黃精多糖得率的影響。

1. 2. 3. 3 提取時間對滇黃精多糖得率的影響 固定其他提取參數為微射流壓力140 MPa、微射流處理次數1次、提取溫度100 ℃、料液比1∶40，在此條件下考察不同提取時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h）對滇黃精多糖得率的影響。

1. 2. 3. 4 提取溫度對滇黃精多糖得率的影響 固定其他提取參數為微射流壓力140 MPa、微射流處理次數1次、提取時間1.0 h、料液比1∶40，在此條件下考察不同溫度（60、70、80、90和100 ℃）對滇黃精多糖得率的影響。采用回流提取法進行多糖提取，避免溶劑蒸發造成的試驗誤差。

1. 2. 3. 5 料液比對滇黃精多糖得率的影響 固定其他提取參數為微射流壓力140 MPa、微射流處理次數1次、提取時間1.0 h、提取溫度100 ℃，在此條件下考察不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60）對滇黃精多糖得率的影響。

1. 2. 4 響應面法試驗設計 在Box-Behnken原理的基礎上，全面考慮單因素試驗所得的相關結果，選取料液比、提取時間及微射流壓力等指標開展響應面分析研究（3因素3水平），優化該提取工藝。以多糖得率作響應值，響應面試驗因素與水平見表1。

1. 2. 5 多糖相對分子質量測定 采用高效凝膠色譜法（HPGPC）測定多糖相對分子質量。多糖樣品配制成所需溶液（2.0 mg/mL），無菌濾膜（0.22 μm）以備用。HPGPC測定分析的主要條件如下：色譜柱Agilent PL aquagel-OH Mixed（300 mm×7.5 mm，8 μm）;柱溫35 ℃;所用示差折光檢測器型號為Waters2414，以超純水作流動相，進樣量和流動速度分別為50 μL和0.6 mL/min。配制系列不同分子量的葡聚糖溶液為標準品作標準曲線，多糖的分子量根據標準曲線計算。

1. 2. 6 單糖組成測定 單糖組成參考范斌等（2021）的方法，采用PMP柱前衍生—高效液相色譜（HPLC）法測定。

1. 2. 7 多糖紅外光譜分析 以溴化鉀壓片作空白對照，采用FT-IR650型傅里葉變換紅外光譜儀進行分析，波數范圍為500～4000 cm-1。

1. 2. 8 DPPH自由基清除能力測定 參考何雪梅等（2014）的方法測定滇黃精多糖抗氧化能力。以維生素C（Vc）作陽性對照。

DPPH自由基清除率（%）=[1-（A樣品-A樣品空白）/

A空白]×100? （2）

式中：A樣品為2 mL樣品+2 mL DPPH自由基溶液;A樣品空白為2 mL樣品+2 mL無水乙醇;A空白為2 mL DPPH自由基溶液+2 mL無水乙醇。

1. 2. 9 多糖降血糖活性能力測定 參考施吉祥等（2019）的方法測定分析滇黃精多糖的α-葡萄糖苷酶抑制能力，采用阿卡波糖作陽性對照，酶活性抑制率按照公式（3）進行計算：

α-葡萄糖苷酶活性抑制率（%）=[1-（A樣品-A樣品空白）/

A空白]×100 （3）

式中：A空白為不加待測樣品反應后的吸光值;A樣品為加入待測樣品反應后的吸光值;A樣品空白為只加入待測樣品反應后的吸光值。

1. 2. 10 酪氨酸酶活性測定 參考Muhammad等（2019）的方法測定滇黃精多糖的酪氨酸酶活性，以熊果苷作陽性對照，根據公式（4）計算酪氨酸酶活性抑制率：

酪氨酸酶活性抑制率（%）=[1-（A1–A2）/（A3-

A4）]×100? ?（4）

式中：A1為樣品吸光值;A2為樣品背景組（PBS溶液代替酪氨酸酶）吸光值;A3為空白組（蒸餾水代替樣品）吸光值;A4為空白背景組（蒸餾水代替樣品、PBS溶液代替酪氨酸酶）吸光值。

1. 3 統計分析

采用Design Expert 8.0.6.1對響應面試驗結果進行分析，以Origin 8.0制圖。

2 結果與分析

2. 1 單因素試驗結果

2. 1. 1 不同微射流壓力對滇黃精多糖得率的影響

由圖1可知，滇黃精多糖得率隨著微射流壓力的增大呈先顯著升高（P<0.05，下同）后逐漸降低的變化趨勢。在80～140 MPa范圍內滇黃精多糖得率迅速升高，多糖得率由10.15%增至18.21%，提高79.41%;微射流壓力在140～180 MPa時，滇黃精多糖得率緩慢下降。微射流壓力的增大有利于多糖得率的提升，但當壓力值高于140 MPa時，多糖溶出無明顯增加。因此，微射流壓力選擇140 MPa為宜。

2. 1. 2 不同微射流次數對滇黃精多糖得率的影響

如圖2所示，隨著微射流處理次數的增加，滇黃精多糖得率并無明顯增大趨勢，不同處理次數間的多糖得率無顯著差異（P>0.05，下同），說明微射流處理次數對滇黃精多糖得率影響較小，處理1次即達到細胞壁破碎的效果，后續響應面試驗無需考察微射流處理次數對滇黃精多糖得率的影響。

2. 1. 3 不同提取時間對滇黃精多糖得率的影響

如圖3所示，在提取時間0.5～1.0 h，滇黃精多糖得率迅速增大，從12.18%顯著提高到17.29%，增加41.95%;而從1.5 h開始，滇黃精多糖得率呈緩慢下降趨勢，到3.0 h時多糖得率顯著降低。表明提取時間達到1.0 h時滇黃精多糖已基本溶出，延長提取時間不能提高得率，反而因溶劑揮發等原因使多糖得率降低，因此后續試驗中提取時間以60 min為宜。

2. 1. 4 不同提取溫度對滇黃精多糖得率的影響

如圖4所示，滇黃精多糖得率隨提取溫度的升高而不斷增大，100 ℃時多糖得率達最大值。對比不同提取溫度之間多糖得率發現，除90和100 ℃外，其余溫度之間多糖得率存在顯著差異，說明提取溫度對滇黃精多糖得率具有顯著影響，提高溫度可促進多糖快速溶出。鑒于試驗結果明確100 ℃時多糖得率最高，且試驗中無法十分精準地控制溫度，故后續提取中直接選取100 ℃為最適提取溫度，在響應面試驗中不再考察提取溫度的影響。

2. 1. 5 不同料液比對滇黃精多糖得率的影響 從圖5可看出，在料液比1∶10～1∶40范圍內，隨著提取溶劑用量的增加，滇黃精多糖得率顯著升高，當料液比低于1∶40時，滇黃精多糖得率反而小幅度下降，但各料液比（1∶40～1∶60）間無顯著差異。因此，滇黃精多糖提取的料液比以1∶40較合適。

2. 2 響應面優化試驗結果

2. 2. 1 回歸模型的建立與分析 采用Design Expert 8.0.6.1進行試驗數據分析，結果見表2。通過對數據回歸擬合分析后，得到各試驗影響因子對多糖得率的二次多項式回歸模型：Y=19.55+0.7A+0.78B+0.89C+0.28AB+1.26AC+0.84BC-1.84A2-4.72B2-2.3C2（R2=0.9860）。

進一步對試驗結果進行顯著性分析，響應面數據的方差分析結果如表3所示，所建立的回歸模型對試驗具有良好的擬合度，因模型達極顯著水平（P<0.01，下同）、失擬項不顯著，說明試驗誤差小。模型的R2為0.9860，說明試驗精確度高，可準確解釋試驗中滇黃精多糖得率的變化，因此，可用該方程對不同提取條件下的滇黃精多糖得率進行預測。根據回歸方程各影響因子的F值可看出，提取時間和料液比對滇黃精多糖得率的影響均達極顯著水平，微射流壓力的影響達顯著水平，由回歸方程式中各項系數可知，提取時間對滇黃精多糖得率影響最大，料液比次之，微射流壓力的影響最小。

2. 2. 2 因素間交互作用分析 由滇黃精多糖得率的回歸分析結果（表3）可知，微射流壓力與提取時間的交互作用對滇黃精多糖得率有極顯著影響，提取時間與料液比的交互作用對滇黃精多糖得率有顯著影響。為更直觀地反映各因素對滇黃精多糖的影響，對回歸模型進行響應面交互作用分析。圖6所示為當提取時間為1.0 h時微射流壓力與料液比間的交互作用。隨著料液比降低與微射流壓力提高，多糖得率呈先增后減的變化趨勢，在微射流壓力為145 MPa和料液比為1∶40左右時達最大值。從等高線和響應面整體來看，料液比的等高線較密，響應面較陡峭，料液比對多糖得率的影響大于微射流壓力的影響。

從圖7和圖8可看出，與微射流壓力與料液比間的交互作用相似，微射流壓力與提取時間、提取時間與料液比之間的交互作用也呈先上升后下降的變化趨勢。微射流壓力與提取時間之間的交互作用對滇黃精多糖得率有極顯著影響，當料液比為1∶40、微射流壓力為147 MPa、提取時間為1.23 h時，多糖得率達最大值，提取時間的等高線較密，響應面較陡峭，對滇黃精多糖得率影響較大。提取時間與料液比之間的交互作用對滇黃精多糖得率有顯著影響，當提取時間為1.1 h、料液比為1∶42時，多糖得率達最大值，等高線呈圓形，二者對多糖得率的影響相差較小。

2. 3 驗證試驗結果

通過Design-Expert 8.0.6.1優化出滇黃精多糖的最佳提取工藝條件為：微射流壓力146 MPa、料液比1∶41.20、于100 ℃下提取1.15 h，預測滇黃精多糖得率為19.83%。為進一步檢驗該試驗方法的可靠性，結合實際操作情況，調整參數為：微射流壓力146 MPa、料液比1∶41、于100 ℃下提取70 min，進行驗證試驗，實際測得滇黃精多糖得率為19.57%，達理論預測值的98.69%，由此可知，通過響應面法優化的提取工藝具有良好的精度與可靠性。

2. 4 滇黃精多糖的相對分子質量

滇黃精多糖經純化洗脫可獲得主峰1個（圖9）。通過HPGPC法測定其相對分子質量，以系列葡聚糖標準品相對分子質量的對數對保留時間作回歸處理，得到重均分子量（Mw）和數均分子量（Mn）的校正回歸方程。根據標準品曲線，得出計算公式進而計算出樣品的分子量大小。

lgMw=-0.208x+12.968（R2=0.993）

lgMn=-0.181x+11.734（R2=0.997）

滇黃精多糖的HPGPC譜圖如圖10所示，經回歸方程計算，滇黃精多糖Mw為35.95 kD，Mn為25.53 kD。首先需進行PDI值（即Mw/Mn）的試驗測定，若該指標較大，說明分子量有較大的分布范圍，反之亦然。滇黃精多糖的PDI值為1.41，該值較小，說明動態超高壓微射流提取的滇黃精多糖較均一。

2. 5 滇黃精多糖的單糖組成

圖11為PMP-HPLC法檢測滇黃精多糖的單糖出峰譜，可知滇黃精多糖由11種單糖組成，單糖中含有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，說明多糖為酸性多糖。11種單糖的摩爾比分別為：甘露糖（43.32%）、半乳糖（20.04%）、葡萄糖（19.87%）、阿拉伯糖（8.67%）、木糖（2.21%）、氨基半乳糖（2.12%）、巖藻糖（1.11%）、氨基葡萄糖（0.95%）、鼠李糖（0.91%）、葡萄糖醛酸（0.52%）和半乳糖醛酸（0.29%）。滇黃精多糖以甘露糖、半乳糖和葡萄糖為主，摩爾比占83.23%，氨基半乳糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的含量較低。

2. 6 滇黃精多糖的紅外光譜分析結果

圖12為滇黃精多糖紅外光譜圖，其中存在著糖類化合物的典型特征吸收峰。3600～3200 cm-1所對應寬峰為-OH伸縮振動吸收峰，是典型的糖類特征峰。具體結果為：在3376.75 cm-1的寬吸收峰是一種典型的糖類特征峰，為糖分子當中O-H伸縮振動吸收峰;在2927.41 cm-1處的吸收峰歸屬于C-H伸縮振動（CH、CH2和CH3）;在1644.98 cm-1處的較強吸收峰可能歸屬于多糖中-OH的彎曲振動;在1421.28和1132.01 cm-1的吸收峰歸屬于C-O伸縮振動;在1328.71和1261.22 cm-1的吸收峰歸屬于O-H變角振動，929.25 cm-1處的吸收峰對應于吡喃環非對稱環伸縮振動，由此可知滇黃精多糖屬于含吡喃環的多糖。

2. 7 滇黃精多糖的DPPH自由基清除能力

從圖13可看出，滇黃精多糖具有一定的清除DPPH自由基能力，其質量濃度與DPPH自由基清除率呈正向量效關系。經計算，滇黃精多糖對DPPH自由基的半抑制質量濃度（IC50）為0.43 mg/mL，高于Vc的IC50（0.056 mg/mL），說明雖然滇黃精多糖有較強的DPPH自由基清除能力，但清除能力遠弱于Vc。

2. 8 滇黃精多糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性

滇黃精多糖具有較強的降血糖活性（劉娜，2017），其α-葡萄糖苷酶抑制活性如圖14所示，經計算，滇黃精多糖對α-葡萄糖苷酶的IC50為4.07 mg/mL，高于阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的IC50（0.83 mg/mL），說明滇黃精多糖雖具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性，但其活性遠低于阿卡波糖。

2. 9 滇黃精多糖的酪氨酸酶抑制活性

酪氨酸酶（EC1.14.18.1，TYR）是一種活性中心含有Cu2+的多功能氧化酶（Muhammad et al.，2019），被廣泛用于評價美白功能。圖15顯示滇黃精多糖的酪氨酸酶抑制活性，進行計算分析后，可得滇黃精多糖對酪氨酸酶的IC50為2.87 mg/mL，高于熊果苷的IC50（0.13 mg/mL），說明滇黃精多糖雖具有較強的酪氨酸酶抑制活性，但其抑制活性低于熊果苷。

3 討論

植物多糖是由10個以上單糖通過糖苷鍵聚合而成的生物大分子，因其多樣的功能活性備受關注。植物多糖的提取主要有破碎細胞壁和多糖提取2個關鍵步驟。植物細胞壁主要由果膠、纖維素和半纖維素組成，起到維持細胞內穩定環境的作用。破壁處理是從胞漿中釋放多糖的關鍵點，不同的破壁方法決定不同的提取方法，如高溫、酸堿、酶解、物理輔助破壁（超聲、微波、高壓等）（王如濤等，2013）。熱水浸提多糖具有安全環保、操作簡單的優點，但得率低、耗時耗能，熱水浸提黃精多糖得率在7%～12%（陳鋼等，2007;郭未艷等，2013;宮江寧等，2019;張梓原等，2020）。酸堿提取法相較于傳統的熱水浸提法雖然得率有所提高，但提取時間并未縮短且易降低活性（王藝涵等，2019）。酶解提取法具有高效、溫和的優點，但存在過濾困難等問題（Lee et al.，2016）。目前物理破碎法提取黃精多糖以超聲波法和微波法為主，具有提取時間短、得率高等優點。微波或離子液體—微波輔助提取黃精多糖，在微波功率280～320W的條件下提取2～3 min，得率即達4.83%～12.79%（粟敏等，2016;于偉凱等，2020）。超聲輔助酶法提取黃精多糖，在65 ℃下提取55 min，得率高達25.63%（劉日斌等，2021）。可見破壁處理輔助提取技術可極大提高提取效率。

動態超高壓微射流又稱微射流均質、瞬時高壓作用、高壓均質，是一種從高壓均質工業應用中開發出來的新型技術，其充分結合了一系列的單元操作，包括膨化、加溫、加壓、粉碎、混合以及輸送等，在食品和制藥領域用于生產體系穩定的乳液，近年來逐漸應用于活性成分提取和改性。本研究利用動態超高壓微射流預處理滇黃精混懸液，該技術通過強烈剪切和高速撞擊等作用，確保滇黃精顆粒能充分地分散于水中，同時有利于細胞壁發生有效破碎，提高細胞通透性，使得溶劑能順利地進入細胞中，促進多糖得率的提升;此外，瞬時壓力作用有利于傳質過程的發生，使得溶劑能迅速地滲透細胞壁，有利于多糖快速地溶出，顯著地縮短提取時間（涂宗財等，2010;李亞楠等，2015;Huang et al.，2018）。在微射流壓力146 MPa、料液比1∶41、100 ℃的條件下提取70 min，滇黃精多糖得率可達19.57%。與傳統的熱水浸提、酸堿法提取、酶解提取法相比，采用動態超高壓微射流獲得的多糖得率提升約一倍，浸提時間從3～8 h縮短至70 min，在提取效率和得率方面表現出巨大優勢。與超聲波輔助和微波輔助提取方法相比，本研究經動態超高壓微射流提取的得率高于微波輔助提取得率（4.83%～12.79%）（粟敏等，2016;于偉凱等，2020），低于超聲波輔助提取得率（25.63%）（劉日斌等，2021），可能與滇黃精的品種和產地不同有關，也可能與操作和計算方法有關。

多糖的生理功能與其組成結構密不可分，有學者對滇黃精多糖的結構和功能進行了研究。吳群絨等（2005）采用熱水提取、柱層析分離純化得到滇黃精多糖，證明其結構為主要由葡萄糖組成、相對分子質量約為8.1 kD的中性多糖;王藝（2019）研究結果顯示滇黃精多糖的分子質量為160 kD，是含有吡喃糖苷鍵的酸性多糖，具有降低餐后血糖、調節體內血糖代謝的作用，但無抗氧化活性;施揚等（2020）制備的滇黃精提取物有著良好的酪氨酸酶抑制活性及較強的抗氧化能力，且無細胞毒性，在日化產品中具有重要的應用價值。本研究采用動態超高壓微射流輔助提取滇黃精多糖，經分析，該多糖是由11種單糖組成的吡喃型酸性多糖，相對分子質量為35.95 kD，與吳群絨等（2005）、王藝（2019）經熱水提取的多糖相比，分子質量較大，單糖組成豐富，且具有較強的生理活性。采用該技術進行提取后，既可促進提取得率的提高，同時對于結構改性方面也有積極作用，該技術能打斷多糖長的分子鏈、改變分子聚集狀態以及降低微粒粒度，導致多糖結構出現一定的變化，最終影響其生物活性與物理化學性質，如提高多糖的抗氧化活性（Chen et al.，2012;Huang et al.，2018;劉夢培等，2021）。下一步將全面地分析動態超高壓微射流技術對于滇黃精多糖功能活性與結構特點的影響機理。

4 結論

采用響應面優化動態超高壓微射流法提取滇黃精多糖的工藝參數，得到最佳工藝參數為：微射流壓力146 MPa、料液比1∶41、于100 ℃下提取時間70 min。利用響應面法建立的回歸模型對滇黃精多糖提取具有良好的預測作用。提取獲得的滇黃精多糖是由11種單糖組成的吡喃型酸性多糖，具有DPPH自由基清除能力、α-糖苷酶抑制活性和酪氨酸酶抑制活性，在健康產品和日化產品開發方面具有廣闊的應用前景。

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（責任編輯 羅 麗）