魚類諾卡氏菌病的研究進(jìn)展

陳海新，朱宇嘉，董碧蓮，朱志東，蔡廷渠，宋健平，朱盛山

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)青蒿研究中心，廣東 廣州510405；2.廣東藥科大學(xué)中藥開發(fā)研究所，廣東 廣州510006；3.廣州市普精生物科技有限公司，廣東 廣州510663)

諾卡氏菌廣泛分布于自然界的水源中，是一種條件致病菌。引起魚類諾卡氏菌病的細(xì)菌主要有星形諾卡氏菌(Nocardia asteroides)、魚諾卡氏菌(Nocardia seriolae)和殺鮭諾卡氏菌(Nocardia salmonicida)。魚類諾卡氏菌病在每年的4－11月皆可發(fā)生，發(fā)病高峰主要集中在6－10月，在水溫25～28℃時發(fā)病最為嚴(yán)重，死亡率最高。該病潛伏期長，從感染到發(fā)病一般需要15～20天，一旦魚發(fā)病預(yù)后極差，采用抗生素療效一般，死亡率高，疾病頻發(fā)，給我國漁業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。如何防治魚類諾卡氏菌病已經(jīng)成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)亟須解決的問題之一。

一、魚類諾卡氏菌病的體征和病理表現(xiàn)

二、魚類諾卡氏菌致病機(jī)制

1.魚類諾卡氏菌入侵宿主及體內(nèi)傳播途徑

滿其蒙等(2012)通過腹腔注射、口灌、浸泡及創(chuàng)傷浸泡的方式使健康卵形鯧鲹感染魚諾卡氏菌，感染后22天死亡率分別達(dá)到93.3%、66.7%、60.0%和73.3%，說明通過腹腔注射、口灌和浸泡都能使健康魚致病，在自然感染的情況下魚諾卡氏菌可從卵形鯧鲹消化道、損傷部位或鰓進(jìn)入魚體內(nèi)。Wang F等(2017)把綠色熒光蛋白標(biāo)記魚諾卡氏菌并注射到透明虎刺魚體內(nèi)，用共聚焦顯微鏡實時觀察諾卡氏菌在體內(nèi)的致病過程，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞內(nèi)有大量的綠色熒光信號，綠色熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)菌被巨噬細(xì)胞吞噬并在細(xì)胞內(nèi)增殖，從而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞聚集、死亡和肉芽腫的形成，最后細(xì)菌通過血液播散到心、肝、腎和肌肉組織并永久定植，形成肉芽腫。

2.MCE(mammalian cell entry)蛋白介導(dǎo)的跨膜運動

3.魚類諾卡氏菌病的免疫原性

索狀因子是存在于流動外脂中分枝菌酸和海藻糖結(jié)合的一種糖脂，由一個酯化的海藻糖和兩個分枝菌酸構(gòu)成，是諾卡氏菌的毒性糖脂，成分為6,6-雙分枝菌酸海藻糖。分枝菌酸可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，降低巨噬細(xì)胞的自噬能力和抗原提呈能力，使巨噬細(xì)胞成為病原體的“避難所”(李黎等，2015)。

抗原85復(fù)合物由Ag85A、Ag85B、Ag85C 3個蛋白組成(編碼基因分別是fbpA、fbpB、fbpC)，負(fù)責(zé)將枝菌酸從一個海藻糖單枝菌酰酯轉(zhuǎn)移到另一個海藻糖單枝菌酰酯，并將其轉(zhuǎn)運到細(xì)胞壁阿拉伯半乳聚糖，形成海藻糖二枝菌酰酯(TDM)(羅紅麗等，2012)。抗原85復(fù)合物在分枝桿菌感染中具有較強(qiáng)的免疫原性，可誘導(dǎo)抗體合成和T細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)。在魚的基因中至少由7個Fbp基因，分別是3個fbpA、2個fbpB和2個fbpC，F(xiàn)bp編碼的抗原85復(fù)合物也很可能是魚諾卡氏菌引起免疫反應(yīng)的原因之一(Yasuike M等，2017)。

4.魚類諾卡氏菌的抗殺傷作用

5.抑制巨噬細(xì)胞的酸化

巨噬細(xì)胞吞噬病原微生物后胞內(nèi)pH會迅速降到5左右。諾卡氏菌并不能在pH為5的培養(yǎng)基中生長，超過50小時就會喪失活力。魚類致病諾卡氏菌在巨噬細(xì)胞體內(nèi)仍然可以維持正常pH抵抗巨噬細(xì)胞的殺滅。這種預(yù)防吞噬體酸化的能力可能是細(xì)胞內(nèi)病原體存活的先決條件。

6.引導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡

三、魚類諾卡氏菌病的復(fù)發(fā)機(jī)制

諾卡氏菌是革蘭陽性細(xì)菌，細(xì)胞壁較厚，一般革蘭陽性細(xì)菌細(xì)胞壁被破壞后就會死亡，部分諾卡氏菌細(xì)胞壁被破壞后仍然能夠在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活，形成L型缺陷細(xì)胞壁，以缺陷形態(tài)繼續(xù)存活，環(huán)境適合時可恢復(fù)典型諾卡氏菌形態(tài)。L型諾卡氏菌的存活是諾卡氏菌病復(fù)發(fā)的重要原因。

四、魚類諾卡氏菌病檢測技術(shù)

王國良等(2012)用SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR的方法檢測魚諾卡氏菌，結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.998，檢測靈敏度可達(dá)106毫克/毫升的DNA含量，與嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、麥?zhǔn)匣【话l(fā)生交叉反應(yīng)，在16份樣品中全部檢測出魚諾卡氏菌，正確率為100%。王國良等(2011)對魚諾卡氏菌16S～23S rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔序列設(shè)計了4條LAMP引物，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后呈現(xiàn)特異性的LAMP梯形條帶，建立了環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)檢測方法，將該法應(yīng)用于烏鱧、大黃魚、黃姑魚組織樣品檢測，準(zhǔn)確檢測出諾卡氏菌。夏洪麗等(2014)針對殺鮭諾卡氏菌的16S～23S轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列擴(kuò)增出128 bp的特異性片段，而對另外2種魚類諾卡氏病致病菌、5種諾卡氏屬近緣種及其他11種細(xì)菌均不擴(kuò)增，對殺鮭諾卡氏菌DNA模板的檢出濃度可低至28.3皮克/微升。

五、魚類諾卡氏菌病的治療

1.抗生素類

滿其蒙等(2013)對恩諾沙星、紅霉素及氟苯尼考體內(nèi)治療鯧鲹的魚諾卡氏菌療效進(jìn)行研究，治療1組和治療2組分別在感染后1天和4天投喂藥餌，連續(xù)投喂10天，恩諾沙星、紅霉素及氟苯尼考治療1組和治療2組對卵形鯧鲹魚諾卡氏菌感染的保護(hù)率分別53.34%和13.34%、43.34%和30%、60%和23.34%。滿其蒙等(2013)對15株魚諾卡氏菌進(jìn)行藥敏檢測，結(jié)果顯示，15株菌均對慶大霉素、恩諾沙星、鏈霉素及卡那霉素敏感，對氨芐西林耐藥。蔣依依等(2012)用紙片擴(kuò)散法測試魚諾卡氏菌對抗生素的敏感性，28℃培養(yǎng)7天后測量抑菌圈直徑，試驗結(jié)果表明該株魚諾卡菌對氯霉素、鏈霉素、卡那霉素、四環(huán)素等敏感，但對磺胺類和氨芐青霉素有耐藥性。王二龍等(2015)用藥敏紙片法測定魚諾卡氏菌對22種抗生素的敏感性，結(jié)果顯示魚諾卡氏菌對四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、美滿霉素、阿奇霉素、磺胺異噁唑、利福平等敏感，對紅霉素、呋喃唑酮、復(fù)達(dá)欣、妥布霉素中度敏感。

2.中草藥

Ismail TF等(2017)從肉桂、百里香、麥冬和茶樹中提煉出4種精油，對魚諾卡氏菌ATCC43993、殺鮭諾卡氏菌ATCC27463和星形諾卡氏菌ATCC19247共80株諾卡氏菌進(jìn)行藥敏試驗，肉桂精油、百里香精油、麥冬精油和茶樹精油對星形諾卡氏菌最小抑菌濃度(MIC)分別可達(dá)5、10、20、160微克/毫升；百里香精油和肉桂精油聯(lián)用時對魚諾卡氏菌和殺鮭諾卡氏菌MIC分別為10微克/毫升和80微克/毫升。鄧劍豪等(2018)使用二倍稀釋法測定中藥復(fù)方DS對諾卡氏菌的MIC值，結(jié)果為3.91毫克/毫升。

3.疫苗

六、討論

魚類諾卡氏菌病頻發(fā)，起病隱匿，病程漫長；一旦發(fā)病預(yù)后極差，給養(yǎng)殖魚產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。諾卡氏菌進(jìn)入宿主體內(nèi)后可以逃離體內(nèi)免疫細(xì)胞特別是巨噬細(xì)胞的殺滅，諾卡氏菌病周期漫長，初期諾卡氏菌數(shù)量較少，引起的炎癥癥狀不明顯，后期諾卡氏菌大量繁殖且難以被免疫細(xì)胞殺滅，會引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，同時機(jī)體不斷修復(fù)損傷組織，最后形成肉芽腫，外觀表現(xiàn)為結(jié)節(jié)，嚴(yán)重時形成膿腫或者瘺管。根據(jù)體征、內(nèi)臟表現(xiàn)和鏡下觀察可做出初步推測，最終確診需要生物技術(shù)的驗證，其中環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)檢測方法比傳統(tǒng)PCR方法更為靈敏、快速和方便。

魚類諾卡氏菌病前期癥狀不明顯，有明顯癥狀時多數(shù)已經(jīng)進(jìn)入后期階段。肉芽腫包裹著大量的諾卡氏菌和壞死組織，雖然可阻止細(xì)菌擴(kuò)散，但同時也阻止了抗生素等藥物進(jìn)入病灶，導(dǎo)致藥物療效一般。魚類諾卡氏菌病前期無肉芽腫阻礙，早期使用藥物可以大大提高藥物療效，改善病魚預(yù)后。因此，在抗生素耐藥的大趨勢下，嚴(yán)密觀察、提前預(yù)防、早期診療也可降低魚類諾卡氏菌病的死亡率，為新型藥物的研發(fā)爭取時間。

魚類諾卡氏菌病防治研究的主要方向有抗生素、疫苗和中草藥等。目前國家禁止在漁業(yè)中使用多數(shù)對魚類諾卡氏菌病有效的抗生素，反復(fù)使用幾種抗生素不可避免地會出現(xiàn)耐藥，且抗生素還會殘留在魚體內(nèi)和水體中，不僅危害人類健康，而且污染環(huán)境。養(yǎng)殖戶為了經(jīng)濟(jì)效益，不規(guī)范使用抗生素更是加劇了這種情況的發(fā)生。疫苗防治魚類諾卡氏菌病有著廣闊的前景，盡管有一些疫苗已經(jīng)問世，但仍然處于實驗室階段，目前尚無針對魚類諾卡氏菌病的商業(yè)疫苗，療效還需時間檢驗。中草藥已經(jīng)有幾千年臨床使用經(jīng)驗，且來源廣泛、價格低廉、療效肯定、可防可治、不易耐藥，對于治療魚類諾卡氏菌病有著巨大優(yōu)勢，但目前關(guān)于中草藥防治魚類諾卡氏菌病的研究較少，需要進(jìn)一步研究。