茜素絡合物對青海湖裸鯉幼魚的耳石標記研究

江華敏，吳金平，吳艷紅，祁洪芳，周衛(wèi)國，付生云，杜 浩，

(1.青海湖裸鯉救護中心，青海省青海湖裸鯉繁育與保護重點實驗室，青海 西寧810016；2.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護重點實驗室，湖北 武漢430223)

青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalskii)屬鯉科、裂腹魚亞科、裸鯉屬，是青海湖中唯一的水生經(jīng)濟魚種，也是國家重點保護物種，在青海湖魚鳥共生生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用。由于生態(tài)環(huán)境的惡化以及過度捕撈等因素的影響，其種群構成日益低齡化，資源面臨枯竭，已嚴重影響青海湖及周邊流域生態(tài)系統(tǒng)的良性循環(huán)(張金蘭等，1997；史建全等，2016)。因此，開展人工增殖放流活動以恢復青海湖裸鯉種群數(shù)量與結構就顯得尤為重要，截至2019年已累計放流青海湖裸鯉1齡魚種1.56億尾。與此相對應，放流后進行效果評價將具有重要意義。當前，青海湖裸鯉資源量和增殖放流效果的評價主要是基于青海湖的水聲學調(diào)查來獲得青海湖裸鯉的資源量、密度分布特征和種群數(shù)量的動態(tài)特征等相關信息(張信，2005；楊君興等，2013)。標志放流是對增殖放流效果進行科學評估的重要手段之一(楊永宏等，2011；張雪等，2013)，但該方法在青海湖裸鯉相關的研究上仍沒有得到很好的應用，尤其是青海湖裸鯉幼魚的耳石熒光物質標記方面的研究尚屬空白。

魚的常用標記法有體外標記法、體內(nèi)標記法、自然標記法、化學標記法、生物遙測法、分子遺傳標記法等，其中耳石熒光標記屬體外標記中的化學標記，該標記方法適合于大規(guī)模增殖放流(張雪等，2013)。1990年，Muncy等通過給魚浸泡、投喂或注射著色劑、染料、放射性同位素、稀土化合物、金屬元素和熒光化合物等無機物，探索化學標記魚的有效方法，而今熒光標記法中的常用物質茜素絡合物使用廣且對于仔稚魚效果較好。熒光標記尤其是ALC標記具有操作簡單、成本低、對受標記對象傷害小、保留率高與檢測直觀等優(yōu)點。但過高的染料浸泡及過長的浸泡時間等都可能對被標記生物產(chǎn)生急性或慢性毒害作用，影響被標記生物的生長、發(fā)育、行為，甚至會造成死亡(耿倩等，2016)。因此，本實驗旨在探索ALC對青海湖裸鯉放流魚種的耳石熒光標記效果，探尋適宜浸泡濃度和浸泡時間，以便為后續(xù)開展增殖放流效果評估提供技術支撐。

一、材料與方法

1.實驗魚和養(yǎng)殖條件

本實驗在青海省西寧市的青海湖裸鯉救護中心開展，實驗所用青海湖裸鯉幼魚為中心2019年7月自行人工繁育的健康苗種(5月齡)。實驗開始前，隨機挑選規(guī)格一致的幼魚[全長(7.0±0.7)厘米，個體重(3.0±1)克，總計1 800尾]作為實驗魚，在清洗消毒后的亞力克魚缸(長32厘米×寬20厘米×高17厘米)內(nèi)暫養(yǎng)，暫養(yǎng)期間連續(xù)曝氣，投喂粉狀飼料，每天投喂2次，換水量為養(yǎng)殖水體的1/4。2019年12月2日開始進行ALC對青海湖裸鯉急性毒性致死性實驗，此實驗期間連續(xù)曝氣，不喂食。根據(jù)急性毒性致死性實驗的結果，于12月9日進行標記有效性實驗，標記期間連續(xù)曝氣，不喂食，標記后轉入循環(huán)水續(xù)養(yǎng)缸(長29厘米×寬4厘米×高9厘米)內(nèi)恢復養(yǎng)殖，續(xù)養(yǎng)時間60天，續(xù)養(yǎng)期間每天投喂2次，每周換水1次，換水量占總養(yǎng)殖水體的1/4。在暫養(yǎng)及整個實驗期間，水溫18～20℃、pH≤8、溶氧4.83～5.18毫克/升，采用自然光照。

2.實驗方法

本實驗的茜素絡合物為上海邁坤化工有限公司生產(chǎn)，規(guī)格為1克/瓶。實驗分為兩個階段，第1階段為茜素絡合物對青海湖裸鯉急性毒性實驗，參考羅穎等(2019)的氨氮對青海湖裸鯉急性毒性實驗。使用ALC對青海湖裸鯉幼魚進行96小時靜水式急性實驗，濃度分別為0、20、25、40、50、80、100、150、160、320毫克/升，并設置對照組，各組隨機選擇10尾魚。持續(xù)觀察96小時，及時打撈死亡個體。實驗中在12、24、36、48、60、72、84、96小時分別記錄標記缸中實驗魚的個體急性死亡數(shù)量，獲得24、48、72和96小時的半致死濃度，計算獲得96小時的安全濃度。

第2階段為茜素絡合物對青海湖裸鯉標記效果實驗，依據(jù)ALC對青海湖裸鯉幼魚的安全浸泡濃度，實驗設置對照組及標記組(30、50、70、80、90、100、130毫克/升)，每組隨機選擇70尾魚進行浸泡實驗，在6、12、24小時分別取樣20尾分組續(xù)養(yǎng)。續(xù)養(yǎng)階段在3天和60天兩個時間節(jié)點測量體重、全長，每組取樣5尾解剖取出微耳石，觀察標記留存率。對空白組和最高濃度組(浸泡濃度130毫克/升、時間24小時的標記組)在3、30、60天3個時間節(jié)點測量體重和全長，通過擬合線性方程判斷生長差異。

3.耳石的提取、制備及檢測

將測量體重、全長后的魚苗置于雙筒解剖鏡下，剖開魚苗的聽囊，用鑷子取出最易于分辨拾取的微耳石，用去離子水清除耳石表面的薄膜及雜質，再用無水乙醇脫水、干燥，避光保存至EP管中。使用尼康倒置熒光顯微鏡ti2-U的可見光、藍色激發(fā)光、綠色激發(fā)光和紫外線光對耳石進行觀察，比較最適光源，并利用顯微鏡自帶的軟件NIS-Elements AR進行圖像處理。

二、結果

1.茜素絡合物對青海湖裸鯉急性毒性濃度

在不同濃度的茜素絡合物溶液浸泡下，根據(jù)浸泡96小時內(nèi)實驗魚死亡情況，使用寇氏法計算茜素絡合物在24、48、72、96小時對青海湖裸鯉的半致死濃度(LC50)，同時計算出24～96小時的置信區(qū)間，再使用Turubell公式計算安全濃度(SC)。

24小時的LC50為205.35毫克/升，置信區(qū)間為140.61～300.61毫克/升；48時的LC50為175.79毫克/升，置信區(qū)間為133.65～231.21毫克/升；72小 時 的LC50為150.66毫 克/升，置 信 區(qū) 間 為113.24～200.45毫 克/升；96小 時 的LC50為138.04毫克/升，置信區(qū)間為81.47～274.79毫克/升。SC為38.78毫克/升。

2.茜素絡合物對青海湖裸鯉幼魚的標記效果

(1)ALC在青海湖裸鯉微耳石上的印跡形態(tài)。在熒光顯微鏡下觀察耳石上的標記效果，發(fā)現(xiàn)未用ALC染色組在綠色、藍色和紫色激發(fā)光下分別呈現(xiàn)純黃、純綠和純藍顏色的耳石顏色。ALC染色組在綠色激發(fā)光下未能看見明顯不同，整個耳石顏色仍然呈現(xiàn)為純黃色。ALC染色組在藍色激發(fā)光下，染色耳石核心部與邊緣部分出現(xiàn)明顯差異，未染色耳石邊緣部仍然是純綠，染色耳石部為藍綠色。ALC染色組在紫色激發(fā)光下，染色耳石核心部與邊緣部分也出現(xiàn)明顯差異，未染色耳石邊緣部為淺藍色，染色成功的耳石部為淡白色。對比90毫克/升浸泡12小時后，在浸泡后3天和60天取樣，可以明顯看到耳石的增長，原有染色標記在60天后仍能有很好的留存。相比較而言，藍色激發(fā)光下對耳石標志的檢測效果最好。

(2)不同濃度ALC在青海湖裸鯉微耳石上的標記效果及留存率。使用藍色激發(fā)光，觀察檢測不同標記濃度續(xù)養(yǎng)3天的實驗魚耳石，按“未見(0)”“微弱(1)”“可見(2)”“明顯(3)”和“強烈(4)”5個等級記錄，發(fā)現(xiàn)隨著ALC濃度和浸泡時間的增加，熒光標記環(huán)標記率和標記強度呈現(xiàn)逐漸增強的趨勢。再比較續(xù)養(yǎng)60天的實驗魚的耳石，標記效果與續(xù)養(yǎng)3天時取出的耳石相比，“強烈(4)”的標記效果無減退現(xiàn)象，耳石邊緣因生長變寬而明顯外移，耳石自發(fā)的綠色熒光與ALC標記環(huán)顏色對比更清晰。但低于“可見(2)”的，標記環(huán)逐漸難以辨認。在30～80毫克/升的標記濃度下，標記效果不明顯，并隨著續(xù)養(yǎng)時間加長而難以觀察；90毫克/升及以上的標記濃度下標記效果加強，隨著時間的加長、濃度的提高逐漸穩(wěn)定，且在浸泡于90毫克/升ALC中12小時效果穩(wěn)定于“強烈(4)”。

3.茜素絡合物標記后對青海湖裸鯉生長的影響

對比標記組和對照組裸鯉的體重、DWG、SGR、存活率，兩組之間沒有顯著性差異(P＞0.05)。標記期間，所有標記組和對照組實驗魚死亡率均為0，游泳能力正常，無異常行為，說明ALC標記對青海湖裸鯉產(chǎn)生的影響較小或者未產(chǎn)生影響。在共計60天的續(xù)養(yǎng)過程中，標記組(染色時長24小時組)和對照組在魚體發(fā)育的成熟度上無明顯差異，攝食和游泳能力皆正常。

經(jīng)在3、30、60天3個時間節(jié)點測量，濃度最高的標記組(130毫克/升濃度、24小時，15尾)與空白組(無標記，15尾)魚的生長差異不明顯，標記組體重擬合線性方程為W＝0.054x＋6.85(R2＝0.9908)，全長擬合線性方程為L＝0.0958x＋2.575(R2＝0.9694)；空白組體重擬合線性方程為W＝0.05665x＋6.7783(R2＝0.9893)，全長擬合線性方程為L＝0.103x＋2.2233(R2＝0.9676)，兩組裸鯉體重和全長的a值相近。

三、討論

1.ALC對青海湖裸鯉幼魚的安全浸泡濃度的確定

熒光標記方法因其成本低、對受試對象損傷小及標記效果好而被廣泛應用于魚的大規(guī)模標記。但標記過程中，藥物的選擇及適宜濃度的確定顯得尤為重要，因為不同魚對于藥物的敏感度不一致，即使同種藥物對不同魚的耐受范圍差異也很大(潘建雄，2019)。本實驗結果表明，在水溫19℃、pH≤8、溶氧4.83～5.18毫克/升的條件下，5月齡青海湖裸鯉幼魚在100毫克/升的ALC中浸泡36小時，其死亡率為20%；150毫克/升的ALC中浸泡36小時，其死亡率為30%；320毫克/升的ALC中浸泡12小時，其死亡率為100%。存活率是衡量較適標記的條件之一。經(jīng)寇式計算法計算急性毒性實驗中的LC50及置信區(qū)間，本實驗確定ALC濃度為90毫克/升時浸泡青海湖裸鯉幼魚12小時是安全的。但也有研究表明，ALC浸泡虹鱒濃度為20毫克/升時就會出現(xiàn)大量死亡，而300毫克/升的ALC浸泡日本牙鲆時還未發(fā)生死亡。靳建波等(2011)用120毫克/升ALC溶液浸泡秦嶺細鱗鮭仔魚12小時，其成活率為92.3%；徐永江等(2016)用150毫克/升ALC溶液浸泡半滑舌鰨魚苗36小時，其成活率為90%。這些研究結果與邱晨等(2019)使用100毫克/升的ALC浸泡48小時標記14日齡鯉仔魚及100毫克/升的ALC浸泡5天標記鯽幼魚，趙亞鵬等(2013)使用100毫克/升ALC浸泡標記90日齡金線鲃稚魚24小時，何春林等(2008)使用300毫克/升的ALC浸泡12小時標記8日齡重口裂腹魚仔魚的研究結果不一致。上述研究結果充分表明不同的受試對象對ALC溶液浸泡濃度的敏感性不一致，這可能與實驗魚種類、規(guī)格及對茜素絡合物的敏感性等因素有關。因此，對每種魚適宜的ALC浸泡濃度與浸泡時間的確定是必要的。

2.茜素絡合物對青海湖裸鯉標記效果

本實驗結果表明，相同浸泡濃度下浸泡時間越長，染色效果越好。綜合考慮存活率和標記率，對于5月齡青海湖裸鯉幼魚最適標記濃度為90毫克/升，標記時長為12小時。該標記濃度下存活率和耳石標記率達100%，且顯示強度均能達到“強烈”。續(xù)養(yǎng)60天后，在熒光顯微鏡下仍能觀察到明顯的標記環(huán)，且耳石自發(fā)的綠色熒光與ALC標記環(huán)顏色對比更加清晰，更易于觀察到，這與鯉仔魚上的研究結果相似(邱晨等，2019)，可見ALC對青海湖裸鯉幼魚耳石的標記效果較好。

3.茜素絡合物標記后對青海湖裸鯉生長的影響

適宜的標記行為對動物的生長、繁殖、生活習性沒有明顯的影響，故而標記放流后的回捕數(shù)據(jù)可用于對放流效果的追蹤評估(劉奇，2009；馬曉林等，2016)。本實驗中，經(jīng)ALC標記處理的青海湖裸鯉幼魚活動等行為與空白組無明顯區(qū)別，游泳能力正常。浸泡處理后，在60天的續(xù)養(yǎng)過程中，標記組魚的活動及攝食等行為與空白組無顯著差異。續(xù)養(yǎng)60天的過程中，對比標記組和對照組的體重、DWG、SGR、存活率，方差分析表明青海湖裸鯉幼魚的生長指標在標記組和對照組間無顯著性差異(P＞0.05)。在續(xù)養(yǎng)的30天和60天的時間節(jié)點，標記組與空白組存活率均為100%，采用直線方程(L＝a·d＋b)擬合空白組和130毫克/升濃度浸泡24小時的標記組，兩組魚體重和全長的a值相近，表明適宜濃度的ALC標記對后續(xù)青海湖裸鯉的生長和存活沒有顯著影響，與朱亞華等(2019)的研究結果一致。

四、小結

在本實驗條件下，青海湖裸鯉5月齡幼魚的最適ALC標記濃度為90毫克/升，浸泡時間為12小時，耳石標記在藍色激發(fā)光下均能達到“強烈”，同時續(xù)養(yǎng)60天后標記仍清晰可見，且與耳石新生長的外延部分可形成明顯對比。本研究結果提供了一種青海湖裸鯉幼魚的增殖放流標記方案，可用于后期青海湖裸鯉增殖放流效果的監(jiān)測。