醋酸氯己定沖洗劑細菌內毒素檢查法研究*

黃 婧，白玲玲，王 婷，蘇 華，王銀娟

（中國人民解放軍東部戰區總醫院藥劑科，江蘇 南京210002）

醋酸氯己定沖洗劑為我院院內制劑［南制字（2016）B501008］，具有消毒、防腐作用，用于創面消毒和沖洗傷口。主要成分為雙胍類化合物醋酸氯己定，通過吸附在細菌胞漿膜使細胞內容物漏出而起到抑菌和殺菌作用，對革蘭陰性菌和陽性菌均有很強的抑制作用［1-2］。該品種收錄于《中國人民解放軍醫療機構制劑規范（2015年版）》［3］中，曾用名為醋酸洗必泰溶液。根據2015年版《中國藥典（四部）》通則0128［4］25-26規定，沖洗劑需要進行細菌內毒素檢查。醋酸氯己定沖洗劑在細菌內毒素檢查中存在干擾，用稀釋法無法消除［5］。本研究中采用二價離子補充劑稀釋劑Ⅰ稀釋樣品以消除干擾，建立了醋酸氯己定沖洗劑的細菌內毒素檢查方法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ET-96型內毒素注射用水（BET）細菌內毒素檢測儀（天津藥典標準儀器廠）；HG71-A型恒溫干燥箱（北京試驗設備廠）；使用的器具、玻璃量器等均按2015年版《中國藥典（四部）》規定除去可能存在的外源性內毒素。

1.2 試藥

細菌內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院，規格為每支80 EU，批號為150601-201681）；鱟試劑1［標 示 靈 敏 度（λ）為0.25 EU/mL，批 號 為1803231］，鱟試劑2（λ為0.06 EU/mL，批號分別為1803052，1804180），細菌BET（規格為每支5 mL，批號為1606160），稀釋劑Ⅰ（規格為每支4 mL，批號為1803130），均購自安度斯生物有限公司；鱟試劑3（λ為0.25EU/mL，批號為1801230），鱟試劑4（λ為0.06EU/mL，批號分別為1806290，1807241），均購自博康海洋生物有限公司；醋酸氯己定沖洗劑（醫院制劑，規格為每瓶500 mL，批號分別為180309，180529，180704）。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核試驗

按2015年版《中國藥典（四部）》通則1143［4］154-157細菌內毒素檢查法復核鱟試劑標示靈敏度，結果鱟試劑靈敏度均在［0.5λ，2λ］范圍內，符合要求。詳見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復核試驗結果Tab.1 The results of TAL sensitivity test

2.2 細菌內毒素限值（L）和最大有效稀釋倍數（MVD）的確定

L：參照2015年版《中國藥典(四部)》通則0128沖洗劑項下規定，每1 mL中含細菌內毒素的量應小于0.50 EU［4］25-26。因此，將醋酸氯己定沖洗劑的L控制在0.5 EU/mL內。

MVD：目前市售鱟試劑的λ范圍為0.03～0.5 EU/mL，按公式MVD=cL/λ（式中，c為供試品溶液的濃度，λ為鱟試劑靈敏度的標示值）計算，對應的有效稀釋倍數為0倍、2倍、4倍、8倍、16倍。結果顯示，0倍、2倍、4倍稀釋液對鱟試劑凝集反應有干擾，故選擇在16倍有效稀釋范圍內對其進行細菌內毒素檢測的干擾預試驗。

2.3 干擾預試驗

預試驗1（BET稀釋）：取樣品(批號為180309)，分別用BET稀釋2倍、4倍和8倍，作為供試品陰性對照（NPC）；各稀釋倍數溶液中分別加入2λ內毒素（0.5 EU/mL），作為供試品陽性對照（PPC）。取2個廠家的鱟試劑（λ為0.25 EU/mL）分別與NPC、PPC溶液反應；將鱟試劑設為陽性對照（PC），BET設為陰性對照（NC）分別進行試驗。結果見表2。可見，稀釋的醋酸氯己定沖洗劑對鱟試劑凝集反應均有抑制作用，即供試品均存在干擾。

表2 干擾預試驗1結果Tab.2 The results of preliminary interference testⅠ

預試驗2（稀釋劑Ⅰ結合BET稀釋）：用稀釋劑Ⅰ將樣品(批號為180309)稀釋2倍后，再用BET分別稀釋4倍和8倍，作為NPC溶液；各稀釋倍數溶液中分別加入2λ內毒素（0.5 EU/mL），作為PPC溶液。取2個廠家的鱟試劑（λ為0.25 EU/mL）分別與NPC、PPC溶液反應，并按常規設PC和NC。結果見表3。可見，稀釋2倍的樣品對鱟試劑凝集反應均無抑制作用，即樣品2倍稀釋液中不存在鱟試劑干擾。

表3 干擾預試驗2結果Tab.3 The results of preliminary interference testⅡ

2.4 干擾試驗

根據預試驗結果，對樣品分別稀釋2倍、4倍、8倍，進行鱟試劑干擾試驗。結果顯示，2倍、4倍稀釋液中均存在干擾，故選取8倍稀釋液進行試驗。取樣品3批，分別用稀釋劑Ⅰ稀釋2倍后，再用BET稀釋，最終為8倍稀釋液，作為NPC溶液，用8倍稀釋的供試品溶液及BET分別稀釋細菌內毒素工作標準品，制成2λ，1λ，0.5λ，0.25λ的溶液。同時使用2個不同廠家的鱟試劑（λ為0.06 EU/mL），按2015年版《中國藥典（四部）》通則1143細菌內毒素檢查法凝膠法［4］154-157進行干擾試驗，結果見表4。可見，將樣品使用稀釋劑Ⅰ、BET稀釋8倍時，對不同批號的鱟試劑與細胞內毒素工作標準品反應均無干擾作用。

2.5 標準建立

取本品，使用稀釋劑Ⅰ對樣品稀釋2倍，再用BET對上述溶液進行稀釋，最終得到稀釋8倍的供試品溶液；取上述供試品溶液及BET分別將細菌內毒素工作標準品制成2λ，1λ，0.5λ，0.25λ的溶液，使用λ為0.06 EU/mL的鱟試劑，根據2015年版《中國藥典（四部）》通則1143檢測供試品溶液中細菌內毒素的含量，每1 mL供試品溶液中細菌內毒素含量應小于0.5 EU［4］154-157。

表4 樣品細菌內毒素干擾試驗結果Tab.4 Results of bacterial endotoxin interference test of the samples

2.6 樣品檢測

取λ為0.06 EU/mL的鱟試劑，按本研究中擬建立的細菌內毒素檢查方法對3批樣品進行常規檢查，結果均呈陽性反應。詳見表5。

表5 樣品細菌內毒素檢查結果Tab.5 The results of bacterial endotoxin test for the samples

3 討論

3.1 細菌內毒素檢查方法

細菌內毒素檢查方法具有試驗條件要求低、檢測速度快、重復性佳、結果精準等優點［6-7］。在2015年版《中國藥典（四部）》附錄中收載的細菌內毒素檢查方法有凝膠法和光度測定法［4］154-157。其中，凝膠法操作簡便，是限量試驗，主要為檢驗機構判定供試品L是否合格的檢驗手段；光度測定法是定量試驗，主要用于藥品生產企業定量測定供試品中含有的L，以提高生產質量［8-9］。故本研究中選用凝膠法。

3.2 稀釋溶劑

醋酸氯己定沖洗劑對鱟試劑細菌內毒素凝集反應有抑制作用［5］，使用BET稀釋無法消除干擾，而使用稀釋劑Ⅰ作為輔助稀釋，可消除干擾［10］。醋酸氯己定沖洗劑主要成分醋酸氯己定含有醋酸根離子，可能與鱟試劑中的單價和二價離子發生反應，而鱟試劑中的單價和二價離子是保持靈敏度的必需成分，故直接使用BET稀釋會抑制鱟試劑與內毒素的反應能力。本研究中選用的稀釋劑Ⅰ為含有一定濃度的二價離子，可飽和醋酸根離子，維持鱟試劑的正常靈敏度［11］。

為了節省檢驗成本，本研究中考察了最佳稀釋方法。結果表明，只要在第一步稀釋樣品時加入稀釋劑Ⅰ稀釋，以后步驟用BET稀釋即可排除干擾。

3.3 稀釋倍數

預試驗中2倍稀釋即無干擾，但正式干擾試驗中，2倍稀釋及4倍稀釋液中分別加入細菌內毒素工作標準品制成1λ，0.5λ，0.25λ的PPC溶液時，與鱟試劑反應均為陰性，故最終選取稀釋倍數為8倍。

3.4 方法評價

本研究中建立的方法可用于醋酸氯己定沖洗劑細菌內毒素的檢查，為可能導致鱟試劑中單價和二價離子缺失樣品的細菌內毒素檢查方法的建立提供參考。