60Co-γ射線輻照滅菌對水蛭抗凝血酶活性的影響

王亞瓊，鐘水生，張華鋒

(蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，蘇州 215104)

藥品的無菌檢驗和微生物限度是藥品質量及監管中涉及安全性的重要檢查指標。《中國藥典》[1](2020年版)中新設立了中藥提取物和中藥飲片的微生物限度，新修訂的《中華人民共和國藥品管理法》[2](以下簡稱新版《藥品管理法》)于2019年12月1日起施行。新版《藥品管理法》加大了對生產銷售偽劣藥品的處罰力度，微生物檢驗不合格的藥品屬于劣藥的范疇。目前中藥常用滅菌方法以濕熱滅菌和輻照滅菌為主，隨著現代工業技術的發展，輻照已經實現了商業化的應用。由于輻照不會引起被輻照物的溫度明顯升高，對熱敏性中藥的殺菌有一定的優越性，同時由于大規格的樣品滅菌非常便捷且成本低，使輻照滅菌的應用越來越普遍[3]。但有研究表明[3-11]，輻照滅菌對中藥的有效成分并非毫無影響，超過5 kGy的輻照劑量會導致多個有效化學成分含量降低。水蛭作為《Co60輻照中藥滅菌劑量標準》[12]中允許輻照的藥材品種，盡管有研究表明輻照對日本醫蛭提取物活性無影響[13]，但目前尚無針對輻照對水蛭藥材活性影響的相關研究。本研究以水蛭抗凝血酶活性為指標，考察輻照對目前市場上常用的水蛭活性的影響。

1 材料

1.1 藥品與試劑

水蛭藥材樣品于2019年采購自亳州市藥材市場零售攤位，詳細信息見表1。純水(美國Millpore公司)；12孔細胞板(美國Corning公司)；牛纖維蛋白原(批號140626-201611，規格凝固物含量44%)、凝血酶(中國食品藥品檢定研究院，批號140625-201712，規格1180單位/瓶)；0.9%氯化鈉溶液(中國大冢制藥有限公司)；三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液：0.2 mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液 25 ml 與0.1 mol/L鹽酸溶液約40 ml，加水至100 ml，調節至pH 7.4；三羥甲基氨基甲烷、鹽酸(國藥集團化學試劑有限公司)。

表1 水蛭樣品信息表

1.2 儀器

AG245電子天平(瑞士Mettler公司)；C-MAG恒溫電熱板(德國IKA公司)。

2 方法與結果

2.1 輻照條件

樣品送蘇州中核華東輻照有限公司進行鈷60γ(60Co-γ)射線輻照，輻照劑量分別為5、10和20 kGy，輻照時間以輻照強度為準。

2.2 供試品的制備

取樣品粉末約1.0 g，精密稱定，精密加入0.9%氯化鈉溶液5 ml，振蕩提取30 min，靜置后，3000 r/min離心5 min，精密量取上清液100 μl，置于12孔細胞板中測定(見圖1)。

圖1 12孔板抗凝血酶活性實驗圖

2.3 測定方法

樣品孔加入含0.5%牛纖維蛋白原(以凝固物計)的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(臨用配制)200 μl，搖勻，置恒溫電熱板上(37±1) ℃、5 min后，滴加每1 ml中含40單位的凝血酶溶液(滴加1次/min，每次5 μl，邊滴加邊輕輕搖勻)至凝固(用于活性較強的樣品)或滴加每1 ml中含10單位的凝血酶溶液(滴加1次/4 min，每次2 μl，邊滴加邊輕輕搖勻)至凝固(用于活性較弱的樣品)，記錄消耗凝血酶溶液的體積，按公式計算：U=(C1V1/C2V2)。式中U為每1 g含凝血酶活性單位(U/g)；G為凝血酶溶液的濃度(μ/ml)；C2為供試品溶液的濃度(g/ml)；V1為消耗凝血酶溶液的體積(μl);V2為供試品溶液的加入量(μl)。中和一個單位的凝血酶量為一個抗凝血酶活性單位。

2.4 樣品測定

選擇活性較弱的藥典收錄品種寬體金線蛭(螞蟥WhitmaniapigraWhitman)各3批次，活性較強的藥典收錄品種日本醫蛭(水蛭HirudonipponicaWhitman)各2批次，活性較強的非藥典收錄品種光潤金線蛭(Whitmanialaevis)各2批次及菲牛蛭(Poecilobdellamanillensis)各3批次，測定其抗凝血酶活性。樣品送輻照，分別接收5、10和20 kGy60Co-γ射線輻照后，再次測定樣品中的抗凝血酶活性，測定結果見表2。

表2 輻照前后水蛭的抗凝血酶活性影響

2.5 數據分析

采用GraphPad Prism 6.0對所得數據進行分析，作圖2和圖3。組間統計學差異通過One-way ANOVA計算。P<0.05為具有統計學差異。

a:P<0.05圖2 輻照前后水蛭抗凝血酶活性比較

a:P<0.05，b:P<0.01圖3 高活性水蛭組輻照前后抗凝血酶活性比較

3 討論

寬體金線蛭由于抗凝血酶活性弱，不同劑量輻照后抗凝血酶活性無統計學差異，但抗凝血酶活性較強的日本醫蛭、光潤金線蛭和菲牛蛭在高劑量輻照下活性降低(見圖2和3)；當輻照劑量超過10 kGy，結果具有統計學差異。

本研究測定方法參考了《中國藥典》(2020年版)水蛭項下抗凝血酶活性法[11]，實驗中將試管改為12孔細胞板，水浴改為恒溫熱板，更便于觀察實驗結果及大批量樣品的測試(見圖1)。相比傳統的試管法結果更易觀察，方法更便捷。

根據以上實驗結果可知，輻照會降低高活性水蛭組的抗凝血酶活性，建議對于具有生物活性的藥材謹慎使用輻照滅菌的方法；如果需要輻照滅菌，建議輻照劑量不宜超過5 kGy。