外源硒對鎘脅迫下紫蘇幼苗生長發(fā)育毒害的緩解效應(yīng)

李 穎，楊小環(huán)，魯一薇，馬金虎

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)社會(huì)服務(wù)部，山西太谷030801）

鎘（Cd）是生物毒性最大的重金屬之一，過量的鎘會(huì)抑制種子萌發(fā)和植物生長，降低葉綠素產(chǎn)量并抑制光合作用，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，降低植物的抗氧化能力，造成作物減產(chǎn)[1-3]；更嚴(yán)重的是，土壤中的鎘通過植物根系富集，經(jīng)食物鏈傳遞進(jìn)入人體，從而危害人體健康[4]。近年來，由于工業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)施肥及污水灌溉等人為因素致使土壤中鎘含量升高[5]。如何緩解鎘對植物的毒害，受到人們的廣泛關(guān)注。

硒是一種對植物生長發(fā)育有益的微量元素[6-7]，是谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的組成成分和活性中心，含硒的GSH-Px 可以催化過氧化物分解，清除植株體內(nèi)自由基，保護(hù)細(xì)胞和細(xì)胞膜免受氧化損傷[8-9]。眾多研究表明，硒參與調(diào)控植物呼吸作用和光合作用、提高抗逆性、抵御植物體內(nèi)自由基的傷害，緩解重金屬的毒害作用[10-12]。郁飛燕等[13]研究發(fā)現(xiàn)，通過對水稻幼苗施加一定濃度的硒，可以緩解鎘脅迫對水稻幼苗生物量的抑制作用，并顯著提高葉綠素含量。呂選忠等[14]研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴硒可降低生菜對鎘的吸收，植物體內(nèi)的硒可誘導(dǎo)谷胱甘肽過氧化物酶活性，進(jìn)而影響整個(gè)酶的保護(hù)系統(tǒng)。饒玲等[15]研究發(fā)現(xiàn)，適量蛋氨酸硒（SeMet）的施用能顯著提高干旱條件下黃瓜幼苗葉片抗氧化酶（SOD、POD、APX）活性，而使其葉片中MDA 含量、O2·-的產(chǎn)生速率和H2O2含量顯著降低。王立新等[16]研究發(fā)現(xiàn)，硒可使植物體內(nèi)H2O2水平、膜脂質(zhì)過氧化程度降低，平衡植物體內(nèi)活性氧的清除和生成，使幼苗的生理機(jī)能得到提高，增加植株的抗鎘脅迫能力。目前，國內(nèi)外硒緩解植物中鎘脅迫的研究主要集中在大麥[17]、水稻[18]、油菜[19]等植物。

紫蘇（Perilla frutescens）是唇形科1 年生草本植物，不僅是旱薄地的優(yōu)勢作物，而且作為藥食兩用的油料作物，具有護(hù)肝降壓、提高免疫力等功效。研究發(fā)現(xiàn)，紫蘇具有重金屬富集作用[20-21]，而在紫蘇上硒緩解鎘毒害作用與機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)采用紫蘇水培的方法，研究噴施不同濃度的硒緩解鎘脅迫對紫蘇早期幼苗的傷害，旨在減輕土壤中的鎘污染對紫蘇的毒害作用，為種植富硒紫蘇提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試紫蘇為2017 年綠色品種（ZB1）白蘇種子，由中北大學(xué)提供。供試硒源為分析純亞硒酸鈉（Na2SeO3），購于Sigma 公司；鎘源氯化鎘（CdCl2），購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料培養(yǎng)與處理 挑選均勻飽滿、無破損優(yōu)質(zhì)的紫蘇種子適量，0.1%HgCl2消毒10 min，去離子水沖洗3～5 次，用濾紙吸干種子表面水分；取適量種子置于培養(yǎng)皿中，在25 ℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)箱中催芽，挑選發(fā)芽一致的種子移至水培盒，置于25 ℃/22 ℃（晝/夜），16 h/8 h（光/暗）培養(yǎng)5 d，依次轉(zhuǎn)移至1/8 和1/4 體積的Hoagland and Snyde（1938）通用配方營養(yǎng)液[22]中各培養(yǎng)5 d；然后將幼苗分成7 組，每組3 盒，再用1/4 體積的Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng)2 d 后處理。

根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)，設(shè)置含2 μmol/L CdCl2營養(yǎng)液水培脅迫，同時(shí)葉面噴施不同濃度的Na2SeO3水溶液，共設(shè)7 個(gè)處理：CK.1/4 營養(yǎng)液；T1.2 μmol/L CdCl2；T2.0.25 μmol/L Na2SeO3＋2 μmol/L CdCl2；T3.0.5 μmol/L Na2SeO3＋2 μmol/L CdCl2；T4. 1 μmol/L Na2SeO3＋2 μmol/L CdCl2；T5. 2 μmol/L Na2SeO3＋2 μmol/L CdCl2；T6. 4 μmol/L Na2SeO3＋2 μmol/L CdCl2。每隔1 d 噴施一次Na2SeO3溶液，3 d 更換一次營養(yǎng)液。待幼苗出現(xiàn)表型差異時(shí)（處理14 d），進(jìn)行各指標(biāo)統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 生物量測定 試驗(yàn)處理結(jié)束后，每個(gè)處理隨機(jī)選取10 株植株，株高的測定從子葉節(jié)點(diǎn)到生長點(diǎn)為基準(zhǔn)，然后將幼苗用蒸餾水清洗2 次，用吸水紙吸干表面水分，分別測定植株地上和根部鮮質(zhì)量并記錄，隨后將其分別放入密封袋內(nèi)，在80 ℃下烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量并記錄。

1.2.3 葉綠素含量測定 葉綠素含量的測定參照明東風(fēng)[23]的方法并加以改進(jìn)。每個(gè)處理隨機(jī)選取5 株完全展開的紫蘇第2 片葉用蒸餾水清洗2 遍，稱取0.1 g 放入25 mL 玻璃管中，同時(shí)加入20 mL 96%乙醇，在黑暗條件下放置至葉片完全變白后，搖勻。用紫外分光光度計(jì)（UV-2450，SHIMADZU，Japan）在470、649、665 nm 波長下測定葉綠素提取液的吸光值（以不加葉片的空白提取液調(diào)零）。

1.2.4 光合指標(biāo)測定 采用美國LI-COR 公司的LI-6800 便攜式光合測定系統(tǒng)在9：00—11：00 測定葉片的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr）。測定時(shí)設(shè)定光合強(qiáng)度（PAR）為300 μmol/（m2·s），相對濕度（RH）為50%，溫度為25 ℃。

1.2.5 抗氧化酶活性測定 超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍(lán)四唑法，過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，過氧化氫酶（CAT）活性測定采用H2O2紫外吸收法，丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸法[24]，超氧陰離子（O2·-）自由基含量測定參照李忠光等[25]的方法進(jìn)行。

1.2.6 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)測定 可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法[24]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 20.0 軟件處理，采用Duncan 新復(fù)極差測驗(yàn)法進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05），利用Excel 2003 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉面噴硒對鎘脅迫下紫蘇幼苗生長的影響

從表1 可以看出，鎘脅迫（T1）顯著抑制紫蘇幼苗的生長，與CK 相比，地上部鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、根部鮮質(zhì)量、根部干質(zhì)量和株高分別降低了24.1%、27.9%、37.1%、30.0%和18.6%，且均達(dá)顯著水平；葉面噴施不同濃度的硒，可不同程度緩解鎘對紫蘇幼苗生長的傷害。葉面噴施1 μmol/L 硒溶液（T4）時(shí)生物量達(dá)到最大，與T1 處理相比，其地上鮮質(zhì)量、地上干質(zhì)量、根部鮮質(zhì)量、根部干質(zhì)量和株高分別升高了31.8%、29.0%、46.8%、28.6%和17.3%。

表1 葉面噴硒對鎘脅迫下紫蘇幼苗生長的影響

2.2 葉面噴施硒對鎘脅迫下紫蘇幼苗光合特性的 影響

由圖1 可知，與CK 相比，T1 處理的葉綠a、葉綠素b、類胡蘿卜素和葉綠素總含量分別顯著降低了51.2%、55.4%、37.8%和52.2%；鎘脅迫下，葉面噴施硒溶液處理的紫蘇幼苗葉綠素含量始終高于T1 處理，且隨著硒溶液濃度的升高均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，當(dāng)濃度為1 μmol/L（T4）時(shí)，葉綠素含量最高，比T1 處理顯著提高了105.5%；T2、T3、T5 和T6 處理的葉綠素含量分別比T1 處理顯著提高了47.38%、67.9%、27.5%和8.1%。

由圖2 可知，與CK 相比，鎘脅迫（T1）處理使紫蘇幼苗的凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導(dǎo)度（Gs）分別顯著降低了46.4%、41.7%、52.1%，胞間CO2濃度（Ci）顯著提高了10.3%；噴施硒可不同程度提高紫蘇幼苗的Pn、Tr、Gs，但均未恢復(fù)到脅迫前水平，同時(shí)降低了Ci；當(dāng)硒濃度為1 μmol/L（T4）時(shí)，Pn 最高，比T1 處理顯著提高了55.2%；當(dāng)硒濃度為0.5 μmol/L（T3）時(shí)，Tr 和Gs 均最高，分別比T1處理提高了28.6%、27.6%，但與T1 處理間差異不顯著；不同濃度硒處理的Ci 差異不顯著。可見，外源硒可以緩解鎘脅迫對紫蘇光合作用的抑制。

2.3 葉面噴施硒對鎘脅迫下紫蘇幼苗抗氧化水平的影響

由圖3 可知，鎘脅迫處理（T1）比CK 顯著提高了紫蘇幼苗葉片和根系抗氧化酶SOD、POD 和CAT 活性，其中，葉片中分別提高了30.2%、290.2%和37.5%，根系中分別提高了68.2%、241.7%和185.9%；不同硒濃度均可降低紫蘇葉片與根系的SOD、POD、CAT 活性，與T1 處理相比，紫蘇幼苗葉片與根系的抗氧化酶活性隨硒濃度的升高呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢，當(dāng)硒濃度為1 μmol/L（T4）時(shí)，抗氧化酶活性最低，其中，葉片的SOD、POD 和CAT 活性分別比T1 處理降低了13.5%、58.7%和36.1%，根中分別降低了26.3%、49.4%和23.8%。值得注意的是，除葉片中CAT 活性恢復(fù)到脅迫前水平外，其余均未恢復(fù)到脅迫前水平。此外，葉中和根中各處理間SOD 活性差異不顯著，而POD 活性差異顯著；葉中CAT 活性在T4 處理顯著降低，而根中的CAT 活性在低濃度硒處理間差異不顯著。

植物體內(nèi)活性氧（ROS）在正常代謝時(shí)維持在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，當(dāng)植物收到外界環(huán)境脅迫時(shí)，超氧陰離子（O2·-）會(huì)大量積累，誘發(fā)細(xì)胞膜發(fā)生膜脂過氧化反應(yīng)，破壞膜的完整性，同時(shí)產(chǎn)生大量的MDA。從圖3 可以看出，鎘脅迫處理（T1）顯著提高了紫蘇幼苗葉片和根系的O2·-和MDA 含量，其中，葉片中O2·-和MDA 含量分別比CK 顯著提高了60.2%和39.6%，根中分別提高了459.6%和144.4%；外施硒可降低紫蘇幼苗O2·-和MDA 含量，隨著硒溶液濃度的升高均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，且在硒溶液濃度為1 μmol/L（T4）時(shí)，O2·-和MDA 含量均達(dá)到最低，其中，葉片中O2·-和MDA 含量分別比T1 處理顯著降低了44.1%和22.9%，根中O2·-和MDA 含量分別顯著降低了60.1%和45.5%。值得注意的是，葉片中O2·-和MDA 含量可恢復(fù)到脅迫前水平，而根中不能恢復(fù)到脅迫前水平。

2.4 葉面噴施硒對鎘脅迫下紫蘇幼苗可溶性蛋白含量的影響

由圖4 可知，與CK 相比，鎘脅迫處理一定程度上降低了紫蘇幼苗葉片、根系的可溶性蛋白含量，分別下降了26.7%和47.2%。與鎘脅迫處理相比，葉面噴施不同濃度硒可不同程度提高紫蘇葉片、根的可溶性蛋白含量，但各處理間未達(dá)顯著水平，其中，T4 處理的可溶性蛋白含量最高，分別比T1 處理提高了24.3%和95.1%。

3 結(jié)論與討論

鎘作為一種具有強(qiáng)烈毒性的重金屬元素，在植物幼苗生長過程中，會(huì)對植物產(chǎn)生毒害作用，損傷根部，抑制水分吸收，阻礙植物的光合作用和蒸騰作用，使植物表現(xiàn)出褪色、矮化、生長延遲等癥狀，造成植物的生物量下降，嚴(yán)重時(shí)甚至死亡[26]。已有研究證實(shí)，硒可有效緩解鎘脅迫對植物造成的毒害[10-12]。本試驗(yàn)中，鎘脅迫后噴施不同濃度硒，紫蘇幼苗的干鮮質(zhì)量、株高均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，葉片中葉綠素含量也呈現(xiàn)相同的變化趨勢。說明硒參與了鎘脅迫下紫蘇幼苗的防御反應(yīng)，從而提高了幼苗耐鎘的能力，促進(jìn)早期幼苗生長，但高濃度的硒會(huì)對植物產(chǎn)生傷害。這與孫紅艷等[27]的研究結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)，鎘脅迫引起植物葉片Pn 降低有2 種原因，即氣孔因素和非氣孔因素，當(dāng)Ci 和Gs 同時(shí)下降時(shí)，氣孔因素是主要的；當(dāng)Ci 升高而Gs 下降時(shí)，非氣孔因素是主要的[28]。本試驗(yàn)中，鎘脅迫降低了紫蘇葉片的Pn，同時(shí)使紫蘇葉片的Ci 升高、Gs 降低，可以推斷紫蘇光合速率下降的主要原因是非氣孔因素。

在植物的抗氧化系統(tǒng)中，SOD 是第一道防線，它能將植物體內(nèi)的O2·-等活性氧轉(zhuǎn)化成H2O2，再經(jīng)由POD、CAT 等將H2O2進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為O2和H2O，從而有效地阻止O2·-和H2O2相互作用對細(xì)胞膜產(chǎn)生更大的傷害[29]。當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)體內(nèi)活性氧物質(zhì)的大量積累會(huì)干擾細(xì)胞的代謝和破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能[30]。本試驗(yàn)中，鎘脅迫下紫蘇幼苗SOD、POD、CAT 活性均顯著升高，可能是由于在鎘脅迫下，植物體啟動(dòng)自身防御系統(tǒng)，通過提高抗氧化酶活性來清除鎘脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量自由基；而噴施硒后，隨著硒濃度的增加SOD、POD、CAT 活性均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，可能是由于低濃度硒的噴施降低了植株體內(nèi)鎘誘導(dǎo)的活性氧自由基，而高濃度硒對植株同樣有毒害作用。值得注意的是，細(xì)胞內(nèi)MDA 含量的高低可反映細(xì)胞膜氧化損傷的程度[31-32]。本試驗(yàn)中，鎘脅迫使紫蘇幼苗，MDA 和O2·-含量均顯著升高，表明鎘對紫蘇的細(xì)胞膜產(chǎn)生了一定程度的傷害，使細(xì)胞膜的透性增加，加快了脂質(zhì)過氧化作用；噴施硒后，隨著硒濃度的增加，MDA 和O2·-含量均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，說明雖然硒對鎘脅迫下的紫蘇細(xì)胞膜有一定的保護(hù)作用，但是過高的硒促進(jìn)過氧化作用。這與郭鋒等[33]在菠菜中的研究結(jié)果一致。

可溶性蛋白質(zhì)是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在逆境條件下通過增加可溶性蛋白質(zhì)的合成，減緩由逆境脅迫造成的生理代謝不平衡[34-35]。本試驗(yàn)中，鎘脅迫處理使紫蘇幼苗中可溶性蛋白含量顯著升高，噴施硒溶液后降低，表明硒對鎘脅迫引起的紫蘇可溶性蛋白含量的上升具有一定的緩解作用，可有效提高鎘脅迫下紫蘇的滲透調(diào)節(jié)能力。

本試驗(yàn)中，鎘脅迫下紫蘇幼苗地上、根部的生物量和株高顯著降低，葉綠素含量顯著減少，光合速率和蒸騰速率顯著降低，抗氧化酶活性、O2·-和MDA含量顯著升高，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量顯著升高，說明鎘脅迫顯著抑制紫蘇幼苗生長。葉片噴施外源硒后，以上指標(biāo)均得到了緩解，其中，1 μmol/L 硒的緩解效果最好，說明噴施適宜濃度的硒可緩解鎘對紫蘇幼苗生長的脅迫傷害，提高紫蘇幼苗對鎘的耐受性。為進(jìn)一步研究紫蘇對鎘的耐受機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。