歐李種質葉片類黃酮含量及不同組分特征研究

任玉琴 付鴻博 雷 晨 王鵬飛 穆霄鵬 張建成 杜俊杰

(1山西農業大學園藝學院，山西 太谷 030801；2黑龍江省農業科學院鄉村振興科技研究所，黑龍江 哈爾濱 150000)

歐李[Cerasus humilis(Bge.)Sok.]是薔薇科櫻桃屬的極矮生灌木果樹[1]，叢狀生長，樹高0.5 ～1 m，枝長0.5 m。歐李花色多種，果色、果形各異，葉片大小、形狀不同，具有很高的觀賞價值，是我國特有的野生果樹之一[2]。歐李在我國十多個省份均有種植，其果實可食用、 加工，根、種子可入藥，葉片含有兒茶素(catechin，CC)、表兒茶素(epicatechin，EC)、蘆丁(rutin，RT)和甘草素(liquiritigenin，LG)等功能物質，可用于生產綠茶和發酵茶等各種保健茶，以及其他功能性產品[3]，具有良好的生態、觀賞、經濟和藥用保健價值。

類黃酮又稱生物類黃酮，是自然界植物中主要活性成分之一，廣泛存于水果、蔬菜、谷物、根莖、樹皮、花卉、茶葉和紅葡萄酒中[4]。類黃酮作為一種重要的次生代謝產物，對多種細菌、真菌、病原體等致病微生物有抑制作用[5]，同時具有擴張血管、降糖降脂、美白等功效[6]，有較高的實用開發價值[7]。兒茶素、 表兒茶素廣泛存在于藥材和茶葉等植物和植物性食物中[8-9]，屬于黃烷-3-醇類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、改善糖尿病和神經退行性病變、調節免疫功能等生物活性[10-12]。黃舒婷等[13]通過對鉤藤葉進行抗氧化活性部位追蹤，發現鉤藤葉抗氧化活性主要與黃酮和多酚等成分相關。孫建瑞等[14]發現豫西山茱萸葉黃酮具有顯著的抑菌和抗氧化能力。崔樹梅等[15]指出根皮素具有抗氧化、抗炎、美白、防曬、抑菌、保濕等多種功效，已被應用于化妝品。研究發現歐李果實具有顯著的抗氧化能力[16-17]，但對葉片類黃酮組分含量研究較少，使葉片功能未得到廣泛開發。

基于前期研究結果，本研究選定38 份歐李葉片種質中含量較高和種質間差異較大的9 種生物活性組分(兒茶素、表兒茶素、甘草素、蘆丁、槲皮素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、楊梅素、光甘草定、根皮素)進行測定，并對其抗氧化能力及酪氨酸酶抑制率進行分析，旨在為歐李后期相關物質的檢測及提取提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2019年7—10月，自山西農業大學園藝站和歐李種質資源圃采集38 份歐李種質資源，每份歐李種質選取3 株植株，每株采集15 ～20 片基生枝中部成熟期葉片，采后的葉片除雜放于-40℃冰箱中保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗儀器及試劑 U3000 超高效液相色譜儀，美國Thermo 公司；UV-5200 紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；SB25-12D 超聲清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司。色譜級甲醇、乙腈均為Merck 品牌，CC、EC、LG、RT、槲皮素(quercetin，QC)、槲皮素-7-O-葡萄糖苷(quercetin -7-O- glucoside，Q3G)、楊梅素(myricetin，MC)、光甘草定(glabridin，GB)、根皮素(phloretin，PR)標準品，北京索萊寶生物科技有限公司，純度≥98%。分析純甲醇，天津市天力化學試劑有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉，天津市凱通化學試劑有限公司。

1.2.2 樣品提取、制備及組分測定 提取液的制備:利用超聲輔助提取法[17-18]，用液氮將保存備用葉片研磨成粉末，用40%的酸化甲醇作提取液，料液比1 ∶10(g ∶mL)，漩渦震蕩混勻，超聲提取30 min(40 kHz)，然后于10 000×g離心15 min，取上清液，共提取3 次，合并上清液，待測。

類黃酮含量(flavonoid content，FC)測定:采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法測定。吸取0.3 mL 提取液于10 mL 容量瓶，先加0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，避光靜置6 min，再加0.3 mL 10%六水硝酸鋁溶液，搖勻，避光靜置6 min，最后加4 mL 4%氫氧化鈉溶液，用40%甲醇定容至10 mL，搖勻靜置10 min，在510 nm 波長處測定吸光度值。以標準品蘆丁做標準曲線。

類黃酮組分測定:采用超高效液相色譜儀測定歐李葉片黃酮組分，取1 mL 提取液過0.22 μm 微孔濾膜后，裝于液相進樣瓶中待測定，使用美國安捷倫Agela Venusil ABS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱子。

流動相:A 相0.5%甲酸水，B 相乙腈，進樣量20 μL，流速0.8 mL·min-1。洗脫程序:0 mim，10%乙腈；0～5 min，13%乙腈；5 ～25 min，16% 乙腈；25 ～30 min，21%乙腈；30 ～45 min，22%乙腈；45 ～50 min，24%乙腈；50～65 min，25%乙腈；65～66 min，10%乙腈；平衡3 min。檢測波長280 nm 和360 nm，測定CC、EC、LG、RT、MC、LG、Q3G；

表1 38 份歐李種質采集地點和日期Table 1 Collection location and date of thirty-eight Chinese Dwarf Cherry Germplasms

流動相:乙腈∶水＝60 ∶40，進樣量20 μL，檢測波長280 nm，測定GB。

流動相:A 相0.02%甲酸水，B 相甲醇，進樣量10 μL，流速0.8 mL·min-1。洗脫程序:0 mim，10%甲醇；0～5 min，20%甲醇；5 ～10 min，35%甲醇；10 ～20 min，40%甲醇；20 ～35 min，75%甲醇；35 ～40 min，10%甲醇；平衡5 min。檢測波長280 nm，測定PR。定性分析根據標準品的保留時間確定、定量分析采用標準曲線法。

1.2.3 抗氧化能力測定 1，1-二苯基-2-三硝基苯脅(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)法[17]測定抗氧化能力。樣品組:吸取0.2 mL 樣品稀釋液，加入2.8 mL 0.1 mmol·L-1的DPPH 溶液，室溫避光反應30 min；空白組:用40%甲醇替代樣品稀釋液。于517 nm波長處測定吸光度值，蒸餾水調零。

1.2.4 酪氨酸酶抑制率測定[19]分別配制pH 值6.8 的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、1.0 mg·mL-1的L-酪氨酸溶液和0.1 mg·mL-1的酪氨酸酶溶液。按照以下配比加樣，測試樣1:2.0 mL PBS＋0.5 mL 酪氨酸酶溶液＋0.5 mL L-酪氨酸溶液；測試樣2:2.5 mL PBS＋0.5mL 酪氨酸酶溶液；測試樣3:0.5 mL 樣品溶液＋1.5 mL PBS＋0.5 mL 酪氨酸酶溶液＋0.5 mL L-酪氨酸溶液；測試樣4:0.5 mL 樣品溶液＋2.0 mL PBS ＋0.5 mL 酪氨酸酶溶液。將各測試樣混勻，將每個樣品的1 ～4 種測試樣混勻，37℃水浴30 min，立即取出在475 nm 波長處測定吸光度值(A1～A4)。按照公式計算提取物對酪氨酸酶抑制率:

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel 2007、SAS 9.2 等軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 不同種質歐李葉片類黃酮含量變異分析

由表2 可知，38 份歐李種質葉片類黃酮的平均值為33.235 mg·g-1，變異系數為41.669%，超過了20%，表明歐李葉片類黃酮的變異較大，遺傳多樣性豐富。38 份種質葉片中CC 含量范圍在6.271 ～935.295 mg·100g-1之間，平均值為304.141 mg·100g-1，在黃酮類化合物中含量占比接近10%，明顯高于其他已測組分含量，且變異系數超過了20%，達到了80.894%。EC、LG、RT、Q3G 含量的平均值分別為43.038、32.133、36.292、27.982 mg·100g-1，而MC、QC、GB 和PR 含量的平均值僅為4.713、6.876、0.032、4.151 mg·100g-1，明顯低于其他組分，表明在已測的類黃酮化合物組分中，MC、QC、GB 和PR 含量較低，但各物質的變異系數均達到60%以上，說明38 份歐李種質葉片中類黃酮各組分含量的變異較大，遺傳多樣性豐富。

表2 38 份歐李種質葉片類黃酮及不同組分含量變異分析Table 2 Analysis of flavonoids and different components in leaves of thirty-eight Chinese Dwarf Cherry Germplasms

2.2 不同歐李種質葉片類黃酮含量的聚類分析

依據歐李葉片類黃酮含量，對38 份歐李種質進行聚類分析，如圖1 和表3 所示。將歐李種質分成可大類，其中:第Ⅰ類超高類黃酮含量種質1 份，含量為64.84 mg·g-1；第Ⅱ類高類黃酮含量種質5 份，含量在48.38～55.67 mg·g-1之間；第Ⅲ類中類黃酮含量種質28 份，含量在19.21 ～47.83 mg·g-1之間；第Ⅳ類低類黃酮含量種質4 份，含量在3.29 ～9.33 mg·g-1之間。其中第Ⅲ類占比相對較高，為73.68%。表明38 份歐李種質類黃酮含量主要集中在19.21 ～47.83 mg·g-1之間。

2.3 不同種質歐李葉片黃酮類物質含量分析

圖1 不同種質歐李葉片類黃酮含量的聚類分析Fig.1 Cluster analysis of leave flavonoid content of different Chinese Dwarf Cherry Germplasms

表3 不同類黃酮含量類型的歐李種質Table 3 Different flavonoid content types in of Chinese dwarf cherry germplasms

對不同種質歐李葉片中黃酮類物質含量進行測定，由表4 可知，9 種物質在不同種質葉片間含量有極顯著差異。其中CC、EC、RT、Q3G 在38 份種質中均能檢測到，CC 含量在6.27 ～935.29 mg·100g-1之間，高于另外3 種物質，且變化范圍最大。LG 在除15-02、15-01、15-51、XLN19-1 4 份種質以外的34 份種質中均被檢測到。在除DG-7、XLN19-01、Ft-1 3 份種質以外的35 份種質中檢測到，含量在0.00 ～12.04 mg·100g-1之間。有11 份種質中不含，其含量在0.00 ～19.67 mg·100g-1之間。GB 含量較低，且僅在9 份種質中檢測到，含量最高為0.19 mg·100g-1，在9種物質中含量最低，且變化范圍最小。PR 在8 份種質中未檢測到，且含量較低，最高含量僅為16.00 mg·100g-1。

2.4 不同種質歐李葉片類黃酮和不同組分與DPPH自由基清除率、酪氨酸酶抑制率的相關性分析

通過對38 份歐李種質葉片的類黃酮含量及DPPH 自由基清除率、酪氨酸酶抑制率進行相關性分析發現(圖3)，歐李葉片的類黃酮與MC 和QC 呈負相關，與CC、EC、RT、Q3G 呈極顯著正相關，其中CC、EC、RT 與類黃酮含量的相關系數都接近0.6。類黃酮含量與DPPH 自由基清除率呈極顯著正相關，與酪氨酸酶抑制率呈正相關，但相關系數僅為0.13，表明類黃酮中對酪氨酸酶起抑制作用的物質含量較低。在9種組分中，除MC、QC、GB 和PR 外，其他5 種組分與DPPH 自由基清除率均呈極顯著正相關，RT 與DPPH自由基清除率正相關系數最大，達到0.67，表明RT 可能是歐李葉片抗氧化活性的主要成分之一。9 種類黃酮組分與酪氨酸酶抑制率相關系數較低，表明9 種組分對酪氨酸酶抑制作用較差。MC 和QC 與除GB 和PR 外其他5 種組分均呈負相關，但MC 與QC 之間呈極顯著正相關，且二者與DPPH 自由基清除率呈負相關。DPPH 自由基清除率與酪氨酸酶抑制率間呈負相關，表明歐李葉片抗氧化和美白之間可能無相關性。

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圖2 不同種質歐李葉片類黃酮和不同組分與DPPH 自由基清除率、酪氨酸酶抑制率的相關性分析Fig.2 Correlation analysis of flavonoids and components in leaves of different Chinese dwarf cherry germplasms with DPPH clearance rate and tyrosinase inhibition rate

3 討論

歐李葉片葉形多樣，常呈倒卵圓形，葉互生，呈螺旋狀排列。葉片上半部寬、下半部窄是歐李區別于其他近緣種(如郁李、麥李)的重要標志。黃酮類化合物是植物次生代謝產物，廣泛存在于高等植物及羊齒植物的根、莖、葉、花、果實中，是許多中草藥的有效成分[20]，由于其生理活性多種多樣，近年來引起了國內外化學家、藥物學家的廣泛重視。

本研究測定了38 份歐李種質葉片的類黃酮、兒茶素、表兒茶素、蘆丁、楊梅素等生物活性物質，并對38份種質類黃酮及各組分進行變異分析，發現各物質的變異系數均超過了20%，表明歐李類黃酮及各組分的變異較大，遺傳多樣性豐富。38 份歐李葉片種質中，類黃酮的含量變化范圍為3.29 ～64.84 mg·g-1，兒茶素含量范圍為6.27 ～935.29 mg·100g-1，平均含量在黃酮類化合物中占比接近10%，高于其他已測組分含量。本研究前期通過對歐李不同種質果實的類黃酮及各組分含量進行測定，發現成熟期果實類黃酮含量顯著低于葉片[21-22]。李國莉等[23]研究表明寧夏枸杞葉片中黃酮含量大于枸杞果實。薛曉芳等[24]比較了棗和酸棗不同器官黃酮含量并分析了抗氧化能力，發現成熟葉片總黃酮含量為7.01 ～9.02 mg·g-1，平均值為7.98 mg·g-1； 且葉片中總黃酮含量高于果實，這與本研究結果一致。

表兒茶素、甘草素、蘆丁、槲皮素7-O-葡萄糖苷含量的平均值分別為43.038、32.133、36.292、27.982 mg·100g-1，而楊梅素、槲皮素、光甘草定、根皮素含量的平均值僅為4.713、6.876、0.032、4.151 mg·100g-1，明顯低于其他組分的含量。其中兒茶素、表兒茶素、蘆丁、槲皮素-7-O-葡萄糖苷在38 份種質中均能檢測到，而有11 份種質中不含有槲皮素。付桂香等[25]比較了7 個不同種質沙棘葉片3 種黃酮類物質的含量，發現蘆丁的含量范圍為9.47 ～389.17 mg·100g-1，且7個種質中都可以檢測到，而槲皮素含量為5.59 ～16.35 mg·100g-1，僅在3 個種質中檢測到。陸勝波等[26]對泡核桃不同器官的黃酮及組分進行測定，發現泡核桃葉片中蘆丁含量顯著高于槲皮素和楊梅素，這與本研究一致，但泡核桃葉片中不含有表兒茶素，且兒茶素含量顯著低于蘆丁，表明不同物種間黃酮類物質含量間存在差異。

本研究通過對38 份歐李種質葉片類黃酮含量進行聚類分析，將其分成了四大類，其類黃酮含量大多集中在中類型種質中，占比超過了80%，表明大多數種質葉片類黃酮含量較高。

本研究對38 份歐李種質葉片的類黃酮含量及DPPH 自由基清除率、酪氨酸酶抑制率進行相關性分析發現，歐李種質葉片的類黃酮與楊梅素和槲皮素呈負相關，與其他7 種組分呈正相關。類黃酮含量與DPPH 自由基清除率呈極顯著正相關，且兒茶素、表兒茶素與抗氧化活性呈極顯著正相關。李鑫等[27]研究發現，酚酸及黃烷-3-醇類物質與抗氧化活性呈顯著正相關，說明這兩類物質在蘋果的抗氧化活性中可能起主要作用。這與本研究中兒茶素和表兒茶素等黃烷醇類物質與DPPH 自由基清除率呈顯著正相關結果一致。王臨賓等[28]對蘋果葉的多酚純化后，發現蘋果葉多酚對DPPH 自由基清除能力有所增強。王磊[29]對天津等地14 種果樹葉的黃酮進行提取，發現其均有抗氧化和抑菌效果，表明部分黃酮類物質有抗氧化效果，與本研究結果相同。

歐李葉片根皮素與酪氨酸酶抑制率呈負相關關系，且歐李葉片類黃酮抗氧化能力與酪氨酸酶抑制率之間呈負相關性，表明歐李葉片抗氧化和美白之間可能無相關關系。張國文等[30]發現根皮素對酪氨酸酶活性有一定的抑制作用，是一種潛在的可逆混合型酪氨酸酶抑制劑。而本研究發現根皮素與酪氨酸酶抑制率呈負相關關系，可能是因為本研究中種質較少，且根皮素含量較低。宋建平等[31]發現三七葉黃酮提取物具有抗氧化能力，并且可以抑制酪氨酸酶活性，而抗氧化能力與抑制酪氨酸酶活性之間呈負相關性，表明三七葉的抗氧化作用是否與其美白功效有關，還需進一步研究。

4 結論

本研究通過測定38 份歐李種質葉片類黃酮及9種(兒茶素、表兒茶素、甘草素、蘆丁、槲皮素、槲皮素-7-0-葡萄糖苷、楊梅素、光甘草定、根皮素)活性物質含量，并分析其抗氧化及酪氨酸酶抑制率能力，確定了歐李03 - 25 品種的兒茶素含量最高為935.29 mg·100g-1，且兒茶素、表兒茶素、蘆丁、槲皮素-7-0-葡萄糖苷與DPPH 自由基清除率呈極顯著正相關，表明其抗氧化能力較強；蘆丁、槲皮素-7-0-葡萄糖苷、光甘草定與酪氨酸酶抑制率有正相關關系。本研究為歐李后期葉片中抗氧化及抑制酪氨酸酶活性物質的提取提供了理論依據，同時有利于歐李葉片功能產品的開發。