小麥鹽脅迫響應相關ERF基因的分離和初步驗證

李世姣 張曉軍 喬麟軼 賈舉慶 常利芳 張樹偉 暢志堅 李 欣

(1山西大學生物工程學院，山西 太原 030006；2山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西 太谷 030800)

土壤鹽漬化是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的主要限制因素之一。目前全球遭受鹽害的耕地超過8 億hm2，其中我國鹽漬土面積達1 億hm2[1-2]。隨著糧食需求的不斷加大，增強作物對鹽漬土壤的耐受性進而提高其產(chǎn)量，對于保障糧食安全意義重大。小麥(Triticum aestirumL.)是世界上種植面積最廣的糧食作物，廣泛發(fā)掘小麥耐鹽基因、培育耐鹽新品種是充分利用鹽漬化土壤的有效途徑。

隸屬AP2/ERF 超家族的乙烯響應因子(ethylene response factor，ERF)在植物應對鹽脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[3]。模式作物擬南芥中，除ERF 以外，AP2/ERF 超家族還包括干旱應答元件結合蛋白(dehydration responsive element binding，DREB)、 PETALA2 蛋 白(PETALA2，AP2)、與ABI3 和VP1 相關蛋白[(related to ABA-insentive3(ABI3)/viviparous1，RAV]和單獨亞族(Soloist)[3]等4 個家族。其中，ERF 和DREB 家族序列相似性較高，均包含1 個AP2/ERF 結構域，但DREB 第14 和第19 位氨基酸分別是纈氨酸(V)和谷氨酸(E)，而ERF 則是丙氨酸(A)和天冬氨酸(D)[3]。目前擬南芥ERF 家族成員ERF1[4]和ERF3[5]被證實可以提高植株耐鹽性。此外，水稻(Oryza sativaL.)OsERF922[6]、大豆(Glycine maxLinn. Merr.)GmERF3[7]和GmERF7[8]、番茄(Solanum lycopersicum)TERF1[9]、JERF3[10]和SlERF5[11]、甘蔗(Saccharum officinarum)SodERF3[12]、煙草(Nicotiana tabacumL.)NtTOE3[13]等10 余個鹽脅迫響應相關ERF基因已被鑒定。

目前小麥中共有8 個ERF基因被鑒定[14-17]，其中有3 個基因與鹽脅迫相關:TaERF1 在小麥受鹽脅迫后表達水平上調(diào)，過表達TaERF1 的擬南芥植株耐鹽性增強[14]；TaERF3 過表達的小麥植株耐鹽性增強，病毒誘導基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)干擾植株則表現(xiàn)為鹽敏感[15]；而TaERF4 過表達的擬南芥植株對鹽脅迫的敏感性增強[16]。其他鹽脅迫相關ERF基因的報道還鮮見。本研究從普通小麥全基因組中分離了ERF 家族，通過系統(tǒng)發(fā)育分析和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析推測可能與鹽脅迫相關的ERF 成員，并進行NaCl 處理下的實時熒光定量 PCR ( real time quantitative PCR，RT-qPCR)驗證，以期發(fā)掘新的小麥耐鹽基因。

1 材料與方法

1.1 植物材料

耐鹽小麥材料CH7034(由山西省農(nóng)業(yè)科學院暢志堅研究員選育)和鹽敏感品種SY95-71[18]用于鹽脅迫處理及RT-qPCR 試驗。CH7034 種子萌發(fā)后的胚芽鞘以及幼苗的根、莖、葉用于基因組織表達水平分析。

1.2 鹽脅迫處理

將小麥種子用1%的雙氧水消毒后放置于培養(yǎng)皿中萌發(fā)，待胚根伸長至2～3 cm 時，選擇長勢一致的種子轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中的1/2 霍格蘭氏營養(yǎng)液中生長，參數(shù)設置為16 h 光照/8 h 黑暗，24℃/16℃；待幼苗生長至兩葉一心期時更換含250 mmol·L-1NaCl 的營養(yǎng)液進行鹽脅迫，在0、6 和12 h 時剪取幼苗根，于-80℃保存，用于RT-qPCR 分析。按上述方法萌發(fā)小麥CH7034，在芽期和苗期分別取胚芽鞘和根、莖、葉，于-80℃保存，用于基因組織表達水平分析。

1.3 序列分離與系統(tǒng)發(fā)育樹構建

利用AP2/ERF 超家族的隱馬爾可夫模型文件(注冊號:PF00847.20)在nhmmer 軟件[19]中檢索普通小麥品種中國春IWGSCv1.0 注釋蛋白序列(下載自URGI 數(shù)據(jù)庫，http:/ /wheat-urgi.versailles.inra.fr/)，設置E≤1e-5，獲得小麥AP2/ERF 序列，將其與109 個擬南芥ERF 家族成員在Clustal X 軟件[20]中進行序列多重比對，并用MEGA 6.0 軟件[21]構建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)聚類結果以及特征序列分離出小麥ERF 家族。根據(jù)NCBI 注冊號下載19 個已克隆鹽脅迫相關ERF基因的編碼蛋白序列，將其與小麥ERF 序列在MEGA 6.0 中構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 基因表達譜與啟動子元件分析

小麥耐鹽品種Arg 和鹽敏感品種Moghan3 受NaCl 脅迫12 h 后的根部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[22](注冊號:SRP158842)下載自NCBI 數(shù)據(jù)庫(http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/)，利用tophat2 將reads 比對到參考基因組IWGSCv1.0 上，并利用cufflinks 進行轉(zhuǎn)錄本組裝[23]，之后利用edger[24]獲得基因序列的FPKM(expression fragment per kilobase of exon model per million mapped reads)值。從中檢索并篩選表達量差異顯著的TaERF 序列，篩選標準為:多重假設檢驗(FDR)值小于0.01、且｜log2(FPKM[t-t0]/FPKMCK[t-t0])｜≥1。所得結果用MeV tool (http:/ /www.tm4.org/mev.html)輸出。

利用PlantCARE 數(shù)據(jù)庫(http:/ /bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對鹽脅迫響應相關ERF基因起始密碼子前2 000 bp 的基因組序列進行啟動子元件分析。

1.5 RT-qPCR

用RNA 提取試劑盒(北京天根生物技術有限公司)提取樣品的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(英杰生命科技有限公司)將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RTqPCR 在羅氏LightCycler ? 96-PCR 儀上進行，使用的酶為SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(北京寶日醫(yī)生物技術有限公司)，內(nèi)參基因為小麥Tubulin，所用引物列于表1。每個反應重復3 次，所得結果采用2-ΔΔCT法[25]進行分析。

2 結果與分析

2.1 TaERF 家族的分離

利用隱馬爾可夫模型文件檢索小麥品種中國春數(shù)據(jù)庫得到559 條AP2/ERF 序列，將其與擬南芥AtERF家族進行聚類，共分為7 個組(圖1-A)，其中有5 個組(組1～3，組6，組7)包含AtERF成員，從上述5 個組中進一步篩選結構域第14 和第19 位分別為丙氨酸(A)和天冬氨酸(D)的序列，獲得229 條小麥ERFs(圖1-B)，在小麥A、B、D 基因組中的數(shù)目為70、78 和81，在第1 至第7 同源群分布數(shù)目依次為36、45、20、30、34、39 和25 (圖1-C)。通過分析A/B/D 同源關系將其歸為96 個TaERF成員。

2.2 TaERF 與已知耐鹽相關ERF 的聚類分析

對96 個TaERF成員與19 個已報道耐鹽相關ERF編碼的蛋白序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結果顯示，有5 個TaERF成員與耐鹽相關ERF聚在同一支中(圖2)。其中，TaERF88 和TaERF27 分別是已報道的TaERF1[14]和TaERF3[15]；而TaERF76、TaERF35 和TaERF85 則分別是擬南芥AtERF3[5]、 水 稻OsERF922[6]和簇毛麥(Haynaldia villosa)DvERF[26]的同源基因。

表1 RT-qPCR 引物Table 1 Primers for RT-qPCR

2.3 數(shù)據(jù)庫中TaERFs 對鹽脅迫的響應

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的分析結果顯示，TaERF家族中有9 個成員(共18 個ERF 序列)在小麥耐鹽品種受鹽脅迫后的表達水平變化顯著，而在鹽敏感品種中變化不顯著(圖3)。其中，TaERF38 在受NaCl 脅迫12 h后表達量下調(diào)，其余8 個成員TaERF3、TaERF27、TaERF28、TaERF55、TaERF56、TaERF64、TaERF67 和TaERF68 在受脅迫后表達量均上調(diào)。

2.4 TaERFs 受鹽脅迫誘導

基于上述分析結果，與已克隆耐鹽ERF基因序列相似性高、或受NaCl 誘導的TaERF成員共有13 個。利用250 mmol·L-1NaCl 對小麥耐鹽材料CH7034 和鹽敏感材料SY95-71 的兩葉一心期植株進行鹽脅迫處理，驗證這13 個成員在根部的表達量變化。RTqPCR 結果顯示(圖4)，TaERF27、TaERF35、TaERF55和TaERF64 共4 個基因在耐鹽材料中受NaCl 脅迫后顯著上調(diào)，而在鹽敏感材料中無明顯變化，可能為鹽脅迫響應基因。

2.5 鹽脅迫響應相關TaERF 的組織表達水平和啟動子調(diào)控元件分析

上述4 個鹽脅迫響應相關成員的序列信息列于表2。其中，TaERF27、TaERF35 和TaERF64 無內(nèi)含子，只含有1 個外顯子，而TaERF55 含有2 個外顯子。

表2 鹽脅迫響應相關TaERF 成員信息Table 2 Information of TaERF members related salinity response

圖1 基于聚類結果和結構特征從小麥AP2/ERF 超家族中分離ERF 家族Fig.1 Isolation of ERF family from wheat AP2/ERF superfamily based on clustering results and sequence characteristics

對鹽脅迫響應相關成員TaERF27、TaERF35、TaERF55、TaERF64 在耐鹽材料CH7034 萌發(fā)和幼苗階段不同組織中的表達水平進行分析(圖5)，結果顯示，上述4 個成員在苗期根和葉中具有較高的表達水平，而在胚芽鞘和莖中的表達量相對較低。其中TaERF35 和TaERF64 分別在苗期根和葉中表達量最高。

隨后對4 個成員起始密碼子前2 000 bp 基因組序列內(nèi)包含的調(diào)控元件進行分析(圖6)，結果顯示，上述成員除啟動子元件TATA-box 和增強子區(qū)域調(diào)控元件CAAT-box，還含有參與茉莉酸響應的順式元件CGTCA-motif、參與脫落酸響應的順式元件ABRE、生長素響應元件TGA-element、參與水楊酸響應的順式元件TCA-element 以及赤霉素響應元件P-box。此外，TaERF27 還含有GARE-motif、AuxRR-core、TATC-box元件，TaERF55 還含有GARE-motif、TATC-box 元件，TaERF64 還含有AuxRR-core 元件。各個調(diào)節(jié)元件功能見表3。

3 討論

耐鹽基因的發(fā)掘利用是改良小麥品種耐受性，降低土壤鹽害的有效措施。目前小麥中除TaERF1[14]和TaERF3[15]外，還 有HTK[27]、SRO[28]、OPR1[29]和AOC1[30]等幾個重要耐鹽基因被鑒定。其中，HTK在育種中的應用使小麥在鹽堿地上的籽粒產(chǎn)量提高了25%[27]。因此，持續(xù)發(fā)掘耐鹽基因?qū)τ诒Ｕ闲←湼弋a(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。

圖2 TaERF 家族與19 個已克隆耐鹽ERF 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of TaERF family and nineteen cloned salinity-tolerance ERFs

圖3 耐鹽品種Arg 和鹽敏感品種Moghan3 受NaCl 處理12 h 后表達水平差異顯著的TaERFsFig.3 The TaERFs expressed significantly differently between salt-tolerant Arg and salt-sensitive Moghan3 after NaCl treatment for 12 hours

圖4 13 個TaERF 成員在小麥耐鹽材料CH7034 和鹽敏感品種SY95-71 受NaCl 脅迫處理的表達水平Fig.4 Expression levels of 13 chosen TaERF members in wheat tolerant material CH7034 and sensitive variety SY95-71 after NaCl treatment

圖5 4 個鹽脅迫響應相關TaERF 成員在小麥耐鹽材料CH7034 萌發(fā)和幼苗階段不同組織中的表達水平Fig.5 Expression levels of four TaERF members related salinity response in wheat tolerant material CH7034 at germination and seedling stage

本研究從小麥全基因組中系統(tǒng)地分離了96 個TaERF家族成員，其中有兩個是已報道的TaERF基因。TaERF88 與已報道的耐鹽基因TaERF1 為同一基因(圖2)，但鹽脅迫處理后TaERF88 在耐鹽品種CH7034 中的表達水平無明顯變化，推測CH7034 中可能有TaERF88 的一個新的等位變異，或者受材料遺傳背景的影響，導致表達水平的變化；TaERF27 是已報道的耐鹽基因TaERF3，研究表明TaERF3 蛋白可通過GCC-box 順式元件來調(diào)控下游應激相關基因，進而提高小麥對鹽和干旱脅迫的適應性。本研究通過利用耐鹽材料CH7034 和鹽敏感材料SY95-71 還鑒定出3 個響應NaCl 脅迫的TaERF，分別是TaERF35、TaERF55和TaERF64，為新的耐鹽相關基因。TaERF55 和TaERF64 在CH7034 中受鹽處理后表達量上調(diào)，在SY95-71 中則無顯著變化，這與轉(zhuǎn)錄組分析結果一致。TaERF35 是水稻OsERF922 的同源基因，其受鹽脅迫誘導后上調(diào)，而OsERF922 過表達的植株對鹽的耐受性降低[6]，因此初步猜測TaERF35 在植株抵御鹽脅迫過程中可能發(fā)揮負調(diào)控作用，但需要進一步試驗證實。

表3 啟動子元件及其功能Table 3 The function of the promoter element

本研究初步鑒定的4 個鹽脅迫響應相關成員TaERF27、TaERF35、TaERF55、TaERF64 在耐鹽材料CH7034 苗期根和葉中均具有較高的表達水平，此外4個成員的啟動子區(qū)域(-2 000 bp)，除包含TATA-box、CAAT-box 元件外，還含有脫落酸、水楊酸、茉莉酸、生長素和赤霉素等多種植物激素響應元件，這幾種植物激素在植物抗旱[31]、抗寒、耐鹽[32]以及應答逆境脅迫信號轉(zhuǎn)導[33-34]等過程中發(fā)揮著重要作用，推測這些成員可能還參與植物多種非生物脅迫信號轉(zhuǎn)導通路。在本研究基礎上，下一步可對TaERF35、TaERF55 和TaERF64 進行功能驗證，并評估其在生產(chǎn)中的利用價值。

4 結論

本研究從小麥全基因組中分離了96 個TaERF成員，在A、B、D 基因組中共有229 個拷貝序列；利用RT-qPCR 證 實TaERF27、TaERF35、TaERF55 和TaERF64 在小麥耐鹽材料CH7034 中受NaCl 脅迫后顯著上調(diào)，而在鹽敏感品種SY95-71 中無明顯變化，推測它們可能為鹽脅迫響應基因，其中TaERF27 是已報道的小麥耐鹽基因TaERF3。這4 個鹽脅迫響應相關基因在CH7034 苗期根和葉中均具有較高的表達水平，此外其啟動子區(qū)域(-2 000 bp)含有脫落酸、水楊酸、茉莉酸、生長素和赤霉素等多種植物激素響應元件。本研究為培育小麥耐鹽品種和探索耐鹽分子機制提供了參考信息。