吳茱萸次堿對棕櫚酸誘導的脂質損傷肝細胞的影響〔1〕

沈萍，李雯，趙燕

(南昌市第九醫院，江西 南昌 330002)

近幾年，隨著人們飲食和生活習慣的改變，非酒精性脂肪肝(NAFLD)的發病率迅速上升，目前已成為全球最主要的慢性肝病。其中，亞洲國家患病率約為27%，歐美等西方發達國家普通成人患病率為20%～33%，且患者呈年輕化趨勢[1-2]。目前仍然沒有針對非酒精性脂肪肝的標準化治療手段，盡管如此，糾正肝臟的脂代謝紊亂仍然是預防和治療非酒精性脂肪肝的一個重要策略。當肝臟內脂質代謝紊亂時，過多堆積的脂肪就會導致脂肪肝。研究表明[3-4]，飽和脂肪酸具有導致脂質毒性的作用。棕櫚酸(PA)是人類血液中含量最高的一種飽和脂肪酸，其在正常范圍內可發揮相應的生理功能，但是在一些特定的病理條件下，組織內的棕櫚酸異常增加，會打破組織內的穩態，增加脂毒性，導致相關疾病的發生。目前已知相關的疾病有高脂血癥、肥胖型心肌病、糖尿病以及腫瘤等[5-6]。吳茱萸次堿(Rut)是蕓香科植物吳茱萸中的一種重要生物活性堿，在傳統中醫藥中廣泛使用[7]，除具有抗炎、抑制癌基因、抗缺血等藥理學效應外，還有抑制血小板聚集的心血管保護作用[8]。本研究從細胞層面上觀察吳茱萸次堿對脂質損傷肝細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

脂質損傷肝細胞(LO2)細胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

杜爾貝科改良伊格爾培養基(DMEM)和胎牛血清購自以色列Biological Industries公司；棕櫚酸鈉和熒光素鈉購自上海阿拉丁公司；吳茱萸次堿標準品(純度≥98%)、BSA-無脂肪酸(d-BSA)、4%組織細胞固定液、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(0.45 μm)、TC處理12孔板用細胞爬片、二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)活性氧(ROS)熒光探針均購自北京索萊寶科技有限公司；細胞增殖及毒性檢測(CCK-8)試劑盒購自美國US Everbright Inc.公司；縫隙連接蛋白32(Cx32)抗體、縫隙連接蛋白26(Cx26)抗體、β-肌動蛋白(β-actin)抗體、過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔免疫球蛋白(IgG)、HRP標記山羊抗鼠IgG均購自博士德生物工程有限公司；化學發光(ECL)試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LO2細胞培養

用含10%胎牛血清(FBS)和1%青/鏈霉素的高糖培養基培養細胞，放置于37 ℃，5% CO2的細胞培養箱中培養，待細胞生長至80%～90%時，用0.25%EDTA胰酶進行消化傳代培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3.2 棕櫚酸和吳茱萸次堿溶液的配制

1.3.2.1 棕櫚酸溶液的配置

稱取33 mg棕櫚酸鈉粉末加入3 mL 0.1 mol/L NaOH溶液中，置于70 ℃水浴皂化約30 min。得到40 mmol/L棕櫚酸鈉皂化液，迅速加入至配制好的40% d-BSA溶液中，得到20 mmol/L PA溶液。適當搖勻，置于50 ℃水浴助溶30 min。室溫冷卻后觀察性狀，呈棕黃色澄清樣，性狀穩定。將PA存儲液于超凈臺中用0.22 μm無菌濾器過濾除菌，每管1 mL凍存于-20 ℃冰柜中。

1.3.2.2 吳茱萸次堿溶液的配置

稱取10 mg吳茱萸次堿標準品粉末，溶解于10 mL甲醇中，得到3.48 mmol/L Rut溶液，將Rut存儲液于超凈臺中用0.22 μm無菌濾器過濾除菌，每管1 mL凍存于-20 ℃冰柜中。

1.3.3 CCK-8實驗檢測細胞活力

細胞接種于96孔板，每組6個平行孔，CO2培養箱中培養過夜；向孔內加入不同濃度的Rut(0.1 μmol/L，0.3 μmol/L，0.5 μmol/L，1 μmol/L)溶液，培養箱內孵育20 min，再向每個孔中加入最佳濃度的PA溶液，干預24 h后棄培養基。每孔加入100 μL CCK-8工作液(CCK-8母液∶DMEM高糖基礎培養基=1∶10)，培養箱內孵育1 h，于450 nm處測定吸光度。

1.3.4 熒光檢測LO2細胞內活性氧的變化情況

取一塊12 孔板，每孔均放入TC處理12孔板用細胞爬片，然后每孔加入LO2細胞懸液，干預方式同前。干預結束后倒掉培養基，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍；加入4%多聚甲醛37 ℃固定30 min；PBS洗3遍，每孔加入1 mL含DCFH-DA熒光探針的工作液(5 μmol/L)作用60 min，終止探針作用時，用PBS清洗細胞2次，取出細胞爬片置于載玻片，用明膠封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5 劃痕負載實驗檢測LO2細胞縫隙連接細胞間通訊的功能

利用熒光黃作為細胞內熒光指示探針，可觀察細胞間的交流。取一塊12 孔板，每孔均放入TC處理12孔板用細胞爬片，然后每孔加入LO2細胞懸液，干預方式同前。干預結束后倒掉培養基，加入含有1%胎牛血清的漢克斯平衡鹽溶液(Hanks′)液輕輕地清洗細胞2～3 次。往12 孔板中加入熒光黃溶液(0.5%)1 mL，用手術刀片在培養板中的玻片上劃痕，放入細胞培養箱中孵育8 min后將染料吸出，再用含1% FBS的Hanks′液洗滌2～3 次，取出細胞爬片置于載玻片，用明膠封片后在熒光顯微鏡下觀察熒光黃染料的傳遞情況并拍照。

1.3.6 免疫印跡實驗檢測Cx26和Cx32蛋白表達

取一塊6 孔板，每孔加入LO2細胞懸液，干預方式同前。棄去培養板內的培養基，提取細胞的總蛋白，采用二辛可寧酸法(BCA)測定蛋白濃度后，在蛋白中加入上樣緩沖液(蛋白體積∶上樣緩沖液=4∶1)，混勻后沸水中煮10 min，使蛋白質變性，再進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并轉膜。采用Cx32，Cx26單克隆抗體和相應二抗分別孵育，以ECL發光法進行顯影，β-actin作為參照物。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 藥物濃度的選擇

2.1.1 LO2細胞脂質損傷模型的建立

以正常培養基和不同濃度的PA分別干預LO2細胞24 h，比較不同濃度的藥物對細胞增殖的影響(見圖1)，以毒性最小且有造模效應的濃度作為PA造模濃度。與對照組相比，0.1 mmol/L PA組、0.2 mmol/L PA組、0.5 mmol/L PA組、0.8 mmol/L PA組、1 mmol/L PA組、2 mmol/L PA組細胞內活力不斷下降，存活細胞不斷減少。最終選取0.2 mmol/L PA作為造模濃度。

未加入PA為對照組；**表示與對照組比較P<0.05

2.1.2 不同濃度吳茱萸次堿對LO2細胞活力的影響

采用CCK-8法分別檢測不同濃度Rut(0.1 μmol/L，0.3 μmol/L，0.5 μmol/L，1 μmol/L)對LO2細胞增殖的影響，結果顯示4個濃度對細胞均沒有毒性(見圖2)。分別選取0.1 μmol/L，0.5 μmol/L，1 μmol/L三個濃度作為低劑量Rut組、中劑量Rut組和高劑量Rut組完成后續實驗。

未加入Put為對照組

2.2 吳茱萸次堿對脂質損傷細胞的活力作用

與對照組相比，給予0.2 mmol/L PA處理后LO2細胞的活力顯著降低，不同濃度的吳茱萸次堿(0.1 μmol/L，0.5 μmol/L和1 μmol/L)均能抑制脂質損傷所致的LO2細胞活力的下降(見圖3)。

1為對照組，即未加入PA和Rut；2為0.2 mmol/L PA組；3為0.2 mmol/L PA+0.1 μmol/L Rut組；4為0.2 mmol/L PA+0.5 μmol/L Rut組；5為0.2 mmol/LPA+1 μmol/L Rut組；##表示與對照組比較P<0.05，**表示與0.2 mmol/L PA組比較P<0.05

2.3 吳茱萸次堿對脂質損傷細胞內ROS的影響

藥物干擾LO2細胞后，采用熒光檢測細胞內活性氧的表達情況，如圖4顯示，與對照組比較，PA刺激細胞后ROS增加，而預先給予吳茱萸次堿(0.1 μmol/L，0.5 μmol/L和1 μmol/L)能夠抑制細胞內ROS增加。

a為對照組，即未加入PA和Rut；b為0.2 mmol/L PA組；c為0.2 mmol/L PA+0.1 μmol/L Rut組；d為0.2 mmol/L PA+0.5 μmol/L Rut組；e為0.2 mmol/L PA+1 μmol/L Rut組；綠色熒光代表ROS

2.4 吳茱萸次堿對脂質損傷細胞縫隙連接細胞間通訊功能的影響

劃痕負載實驗結果顯示，與對照組對比，PA可顯著抑制熒光黃染料的傳遞，預先給予Rut(0.1 μmol/L，0.5 μmol/L，1 μmol/L)可顯著改善高脂誘導的縫隙連接細胞間通訊(GJIC)功能障礙(見圖5)。

a為對照組，即未加入PA和Rut；b為0.2 mmol/L PA組；c為0.2 mmol/L PA+0.1 μmol/L Rut組；d為0.2 mmol/L PA+0.5 μmol/L Rut組；e為0.2 mmol/L PA+1 μmol/L Rut組；綠色熒光代表代表熒光黃探針

2.5 吳茱萸次堿對縫隙連接蛋白Cx26和Cx32表達的影響

免疫印跡實驗(Western blotting)結果顯示，與對照組比較，PA組Cx32和Cx26的蛋白表達水平顯著下降，不同劑量的吳茱萸次堿(0.1 μmol/L，0.5 μmol/L，1 μmol/L)均可恢復Cx32和Cx26蛋白的表達水平(見圖6)。

1為對照組，即未加入PA和Rut；2為0.2 mmol/L PA組；3為0.2 mmol/L PA+0.1 μmol/L Rut組；4為0.2 mmol/L PA+0.5 μmol/L Rut組；5為0.2 mmol/L PA+1 μmol/L Rut組

3 討 論

近幾年來，縫隙連接(GJ)在肝臟疾病中的作用日益受到重視。GJ是溝通相鄰細胞胞質的細胞間通道，允許相對分子質量小于1.5 kD的離子、代謝物及第二信使(如cAMP，Ca2+，IP3)通過。細胞間普遍存在GJ，相鄰細胞通過GJ進行信息和物質能量的交流，在組織生長發育、維持細胞內環境穩定、細胞分裂分化和腫瘤形成發展中發揮重要作用[9]。GJ由相鄰細胞膜上的兩個連接子互相錨定組成，而連接子則是由六個啞鈴型蛋白亞單位-連接蛋白(Cx)組成的六聚體。肝臟結構中存在豐富的GJ，廣泛參與肝臟的生理功能，甚至發揮關鍵作用。目前已有多達5種Cx在肝臟中被檢出，其中肝細胞主要表達Cx32和Cx26，而非實質細胞主要表達Cx37，Cx40和Cx43[10]。因此，本研究的目的之一是觀察高脂狀態的肝細胞中Cx32，Cx26的表達和GJIC功能的變化。

吳茱萸次堿是傳統中藥吳茱萸的主要有效成分，是一種吲哚喹唑啉類生物堿，具有廣泛的藥理效應，例如緩解消化性潰瘍、抑制血小板聚集、抗血栓形成、抗炎等，這些作用可能與下調還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶活性，減少ROS產生密切相關[11]。已有研究表明，Rut可減輕高糖誘導的內皮細胞損傷，恢復內皮Cx37表達和GJIC的功能[10]，故而本研究首次在細胞層面上探討吳茱萸次堿對脂質損傷肝細胞的縫隙連接蛋白和(GJIC)功能的影響。

棕櫚酸是飽和游離脂肪酸的一種，已廣泛應用于脂毒性誘導細胞損傷模型的建立[12]。本研究利用PA建立人肝細胞的脂質損傷模型，結果顯示，PA刺激細胞后導致細胞活性降低、細胞內活性氧增加、GJIC功能障礙以及Cx32和Cx26表達量減少；使用吳茱萸次堿預處理LO2細胞后，可減輕PA誘導的細胞損傷，并且恢復Cx32和Cx26的表達和GJIC的功能[13]。本研究通過探討肝細胞Cx32和Cx26表達及通訊功能的變化，為治療非酒精性脂肪肝提供潛在的靶向治療位點、顯著改善NAFLD臨床預后以及開發新作用靶點的抗脂肪肝病變藥物提供思路。