白藜蘆醇激活SIRT1抑制高糖誘導的神經細胞凋亡

劉遠波，王 霞，包太成，李南京，譚秋芬，林小龍

(1. 惠州市第六人民醫院神經內科，廣東省惠州市516211；2.廣州醫科大學附屬惠州醫院惠州市第三人民醫院病理科，廣東省惠州市516002)

葡萄糖是中樞神經系統必需的能量底物，神經元需要大量的葡萄糖來滿足其高能量的需求。與依賴胰島素的肌肉細胞或脂肪細胞不同，神經元的葡萄糖攝取主要取決于其細胞外濃度。如神經元長期暴露于葡萄糖中會引起氧化應激，導致細胞損傷，并導致神經病理性并發癥，如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)和帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的發生[1-2]。最新的研究也顯示PD的發生與2型糖尿病密切相關[3]。白藜蘆醇(resveratrol，RESV)是一種多酚類天然化合物，其因強大的抗氧化、抗炎和心肌保護作用而備受關注[4]。近年來，大量研究證實RESV可以通過趨化因子受體4(CXC chemokine receptors 4，CXC4)、磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶(PI3K/Akt)等途徑拮抗缺血再灌注所致的神經細胞損傷，進而保護神經細胞[5-6]。雖然白藜蘆醇在神經退行性疾病中有較好的防御作用，但其在保護神經元免受高糖(high glucose，HG)損傷方面的作用及機制尚待闡明。沉默信息調節因子1(silence information regulator 1,SIRT1)是SIRT家族的重要成員，具有抗衰老的作用，研究顯示，在腦缺血時SIRT1活性增強，細胞生命周期延長，抵抗應激能力增加，對致命性腦缺血起到神經保護作用[7]。此外，研究顯示SIRT1在高糖誘導的神經細胞損傷時，具有拮抗氧化應激的能力[8]，表明SIRT1可能是神經細胞拮抗應激損傷的重要靶標。因此，本研究擬以PC12細胞為研究對象，闡明RESV是否通過誘導SIRT1的活化抑制HG導致的PC12細胞凋亡。

1 材料和方法

1.1 材料

甲基噻唑基四唑侖(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、Hoechst33258、20，70二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)、D-葡萄糖及白藜蘆醇均購自美國Sigma公司；SIRT1、p-SIRT1、AMP活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate activated protein kinase,AMPK)、p-AMPK及SIRT1抑制劑均購自Abcam公司；PCR試劑盒購自北京康為世紀生物有限公司；所有細胞培養相關試劑均購自Thermo Fisher公司；增強化學發光(ECL)劑購自碧云天生物有限公司；其余試劑均購自國內外分析純。

1.2 細胞培養及分組

PC12細胞用RPMI-1640培養基(含10%胎牛血清，100 kU/L青霉素及100 kU/L鏈霉素)，在37 ℃5%CO2環境中培養。每2天傳代1次。傳代后，PC12細胞以2×106個/孔進行接種，接種條件為10%小牛血清孵育24 h，隨后改為0.5%FBS RPMI-1640培養基饑餓24 h。

PC12細胞分為4組。對照組為5 mmol/L葡萄糖孵育24 h；高糖組(HG組)為50 mmol/L葡萄糖孵育24 h；白藜蘆醇組為10 μmol/L白藜蘆醇預處理2 h；高糖+白藜蘆醇組為白藜蘆醇組基礎上用高糖處理24 h。

1.3 MTT檢測

PC12細胞按5×103個/孔置于96孔板中，按照分組培養細胞。隨后在每孔加入10 μL MTT溶液，于37 ℃孵育4 h。最后在光密度470 nm處進行測量，計算細胞存活率。

1.4 Hoechst33258核染色評估細胞凋亡

各組細胞處理后，用冰凍4%多聚甲醛固定30 min，隨后浸泡于PBS溶液中20 min。PBS浸泡后用含5%山羊血清的0.3%TritonX-100封閉2 h。封閉完成后用PBS洗滌2次，每次20 s，最后加入10 mg/L Hoechst33258染液在常溫暗室中孵育15 min。孵育完成后用熒光顯微鏡觀察凋亡細胞情況。凋亡細胞表現出凝聚、斷裂或扭曲的細胞核；活細胞表現出正常的核大小和均勻的熒光。

1.5 細胞內活性氧檢測

通過測定DCFH-DA氧化形成的熒光產物，測定細胞內活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平。去除培養瓶內培養基，隨后PBS洗滌細胞3次。加入新鮮培養基后，用10 μmol/L DCFH-DA在37 ℃下孵育30 min。隨后再用PBS再次洗滌細胞，熒光顯微鏡觀察并采集圖像。使用Image J 1.41軟件測量5個隨機場平均熒光強度，結果以各組熒光強度與試劑盒陽性試劑熒光強度的百分比表示。

1.6 蛋白印跡分析

收集各組細胞，提取各組細胞的總蛋白質，用BAC試劑盒(按說明書操作)測定各組蛋白質水平，按SDS-PAGE試劑盒操作說明，配置5%濃縮膠和10%分離膠進行電泳，電泳完畢后根據Marker顯示的位置，切取各個目標蛋白所對應的相應膠帶進行轉膜，轉膜條件為200 mA恒流2 h，隨后用TBST配置5%牛奶封閉2 h。一抗過夜，兔抗SIRT1單克隆抗體(1∶2 000)，兔抗p-SIRT1(Ser473)單克隆抗體(1∶2 000)，兔抗AMPK多克隆抗體(1∶2 000)，兔抗p-AMPK(Ser253)多克隆抗體(1∶1 000)。次日，將膜取出，在TBST中洗滌膜3次，隨后加入二抗孵育2 h。然后在TBST洗滌3次，隨后加入ECL發光試劑，并在天能5200SE凝膠系統中進行照片拍攝及分析。

1.7 實時熒光定量PCR

根據TRIZOL試劑說明書對相關的樣本進行RNA提取。按照Taqman反轉錄試劑盒操作說明反轉錄1 μg RNA。根據試劑盒說明書中的方法,利用SIRT1和AMPK引物進行實時熒光定量PCR反應,并選擇人GAPDH作為內參基因。引物序列如下：SIRT1前導鏈引物5′-TAG CCT TGT CAG ATA AGG AAG GA-3′，SIRT1后隨鏈引物5′-ACA GCT TCA CAG TCA ACT TTG T-3′；AMPK前導鏈引物5′-TTG AAA CCT GAA AAT GTC CTG CT-3′，AMPK后隨鏈引物5′-CAG GGA TGT GAT CGG CAC TT-3′。實時熒光定量PCR反應于實時熒光定量PCR儀(Roche)中,按程序進行。預溫育50 ℃110 s，95 ℃120 s，1個循環；擴增60 ℃55 s，95 ℃15 s，55個循環;解鏈95 ℃15 s，65 ℃60 s，97 ℃3 s，1個循環；冷卻37 ℃30 s，1個循環。

1.8 統計學方法

2 結 果

2.1 HG對PC12細胞SIRT1和AMPK表達及磷酸化的影響

與對照組比較，用50 mmol/L HG處理PC12細胞不同時間，SIRT1和AMPK RNA及總蛋白水平沒有發生改變(圖1)，但磷酸化蛋白表達與對照組比較，磷酸化水平明顯下調，并呈現出一定的時間依賴性。處理6 h后，p-SIRT1及p-AMPK的表達下降明顯，在處理24 h時下降最為明顯(P<0.05，P<0.01；圖1)。

圖1 HG對PC12細胞SIRT1和AMPK表達及磷酸化的影響A和B為RT-PCR檢測結果；C和D為Western blot檢測結果。1為對照組；2～6分別為HG 0、3、6、12和24 h組。a為P<0.05,b為P<0.01，與對照組比較。

2.2 RESV對HG處理PC12細胞SIRT1和AMPK表達及磷酸化的影響

RESV預處理30 min，隨后HG處理細胞24 h，結果發現：與HG組比較，HG+RESV組可顯著提高細胞內p-SIRT1的水平，但并不影響總SIRT1蛋白表達，對SIRT1下游分子AMPK蛋白進行檢測，p-AMPK的表達水平與p-SIRT1表達相一致(P<0.05，P<0.01；圖2)。

圖2 RESV對HG處理的PC12細胞SIRT1和AMPK表達及磷酸化的影響1為對照組；2為高糖組；3為白藜蘆醇組；4為高糖+白藜蘆醇組。a為P<0.01，與對照組比較；b為P<0.01，與高糖組比較。

2.3 HG對PC12細胞ROS、凋亡率及存活率的影響

與對照組比較，HG處理6 h后PC12細胞ROS水平及凋亡率明顯增加，細胞存活率明顯降低，24 h時該作用更為顯著(P<0.05，P<0.01；圖3和表1)。

圖3 HG對PC12細胞ROS水平及凋亡的影響上圖為熒光光度法檢測PC12細胞ROS水平(200×)；下圖為Hoechst33258核染色檢測PC12細胞的凋亡情況(400×)。

表1 HG對PC12細胞ROS水平、凋亡率及存活率的影響 單位：%

2.4 RESV對HG誘導PC12細胞ROS、凋亡率及存活率的影響

RESV預處理30 min，隨后HG處理細胞24 h，結果發現：與HG組比較，HG+RESV組細胞ROS水平和凋亡率明顯下降，細胞存活率明顯提升(P<0.05，P<0.01；表2和圖4)。

表2 RESV對HG誘導PC12細胞ROS水平、凋亡率及存活率的影響 單位：%

圖4 RESV對HG誘導PC12細胞ROS水平及凋亡的影響上圖為熒光光度法檢測細胞ROS水平(200×)；下圖為Hoechst33258核染色檢測PC12細胞的凋亡情況(400×)。

3 討 論

糖尿病患者血糖調節異常所導致高血糖狀態是糖尿病神經病變的主要原因[9-10]。目前對于高血糖致神經病變的機制尚不清楚。越來越多的研究表明，氧化應激與代謝綜合征、糖尿病、糖尿病神經病變和多種神經退行性疾病(如PD和AD)的進展有關[11-12]。而ROS的產生是氧化應激發生的基礎。研究證實，高血糖持續存在可促進葡萄糖通過氧化作用形成晚期糖基化終產物產生ROS，進而對神經元產生直接毒性作用[13]。而持續的高糖刺激會上調神經細胞β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1表達及ROS的產生，進而活化低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)及LXRα/ABCA1通路調節脂筏重組，最終導致細胞內β-淀粉樣蛋白沉積及細胞的凋亡，進而促進AD的進展[14]。此外，高血糖會抑制天然抗氧化劑/活性氧清除機制，從而增加活性氧的累積，例如，高血糖會抑制硫氧還蛋白的ROS清除功能，硫氧還蛋白是一種通過p38 MAPK介導的硫醇還原酶[15]。而最新的研究發現，硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)在高血糖狀態下神經細胞的表達明顯提高，并抑制細胞內的線粒體自噬，增加細胞的ROS累積，促進神經細胞凋亡，進而加速PD的進展[16]。本文的結果同樣顯示，HG可促進胞內ROS產生并引起神經細胞的毒性作用，表明ROS產生可能是引起神經細胞損傷的重要基礎。因此，抑制ROS的產生，對神經退行性病變的防治具有重要的意義。

白藜蘆醇具有很強的抗炎、抗氧化及線粒體保護作用，并對神經退行性疾病具有一定的預防和治療作用[17]。有研究證實，白藜蘆醇可通過激活PI3K/Akt/Nrf2信號通路，上調血紅素加氧酶-1的表達，抑制β淀粉樣蛋白沉積誘導的氧化應激，有助于AD的治療[18]。另有研究發現，白藜蘆醇可通過激活AMPK/PI3K/Akt信號通路，上調Tau蛋白磷酸酶2的表達，下調Tau蛋白激酶糖原合成酶激酶-3β的表達，從而抑制Tau蛋白過度磷酸化，改善AD相關癥狀[19]。此外，通過研究魚藤酮誘導的PD大鼠模型證實，白藜蘆醇可通過激活谷胱甘肽過氧化物酶和Nrf2信號通路，顯著下調CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白和葡萄糖調節蛋白78的表達，減弱Caspase-3和黃嘌呤氧化酶的活性，降低IL-1β水平，從而保護神經元免受內質網應激誘導的凋亡，恢復多巴胺水平，改善PD[20]。而課題組前期研究發現，白藜蘆醇可以通過PI3K/Akt/Fox3a通路抑制HG誘導的神經細胞損傷[21]，表明白藜蘆醇具有拮抗HG誘導神經細胞凋亡的潛能，而這在本文中得到證實。SIRT1作為抗衰因子，其在腦缺血再灌注中的保護作用得到大量的研究證實，但在HG誘導的神經細胞損傷中是否也具有保護作用，尚未見過多的文獻報道。本文在50 mmol/L HG誘導PC12細胞損傷模型中，白藜蘆醇可以明顯促進磷酸化SIRT1的表達，抑制HG所誘導的ROS產生，增強細胞存活率并抑制細胞凋亡，表明SIRT1可能是白藜蘆醇保護神經細胞免受HG損傷的潛在靶標。課題組將會在將來的研究中進一步證實。

AMPK是調節細胞代謝、自噬等病理生理過程的重要因子，目前大量研究證實SIRT1可通過誘導AMPK的磷酸化參與保護缺血再灌注所致的心肌或者神經細胞的損傷[22]。而最新的研究顯示，在HG誘導心肌細胞損傷中，白藜蘆醇可以通過SIRT1/AMPK通路拮抗氧化應激所致的心肌損傷[23]。因此，本實驗推測SIRT1/AMPK通路可能也參與白藜蘆醇拮抗HG誘導神經細胞的損傷。故在本文中也對AMPK的表達以及磷酸化AMPK表達進行檢測。結果顯示，HG可抑制PC12細胞p-AMPK的表達，而白藜蘆醇預處理后，HG的抑制作用被逆轉，表明白藜蘆醇可能是通過激活SIRT1/AMPK通路發揮神經保護作用，而這與以往文獻的報道結果相似[24]。

綜上，本研究結果提示HG可以抑制神經細胞SIRT1和AMPK的磷酸化，促進細胞內ROS的產生及細胞凋亡，而這種現象可被白藜蘆醇所抑制。此外，SIRT1活化被抑制后，白藜蘆醇的保護作用被逆轉。表明白藜蘆醇是通過激活SIRT1/AMPK通路抑制高糖誘導的神經細胞的凋亡。然而當前的研究僅限于體外實驗，需要進一步體內實驗進行驗證，而這也是課題組將來實施的目標，而這可為白藜蘆醇的神經保護作用提供新的理論依據，并為HG所致的神經退行性病變提供新的治療靶標。