Pygo2、M2BPGi在慢性乙型肝炎肝纖維化患者血清中的表達及聯(lián)合診斷價值

于麗華，王 宏，秦 麗，張冬梅，崔東燕，趙書平

(1.海軍青島特勤療養(yǎng)中心檢驗科，山東省青島市 266071；2.泰安市中心醫(yī)院檢驗科，山東省泰安市271000)

肝纖維化是肝細胞變性或壞死后機體發(fā)生的正常修復過程，其病理表現(xiàn)為纖維結締組織在肝臟組織中過度沉積[1]，而慢性乙型肝炎患者均伴有不同程度肝纖維化，若不及時有效控制病毒感染程度，肝纖維化會進展成肝硬化、肝癌等疾病，嚴重威脅患者生存質量和生命安全[2]。若及時判斷乙肝患者纖維化分期，并對癥干預治療，將會逆轉肝臟纖維化程度，降低肝硬化、肝癌等疾病發(fā)生率，進而提高患者生存質量[3]。目前臨床上以肝穿刺病理組織活檢為肝纖維化診斷的金標準，可有效診斷出肝纖維化病理分型，但其具有入侵性，患者依從性較差[4]。而血清指標因其檢測快捷、耗時短及創(chuàng)傷小被臨床推廣，傳統(tǒng)肝纖維化血清診斷指標雖具有快速、便捷的特點，但易受外界環(huán)境的干擾，診斷效能較低[5]。因而找尋高特異度和靈敏度的血清指標，對提高肝纖維化臨床檢出率具有重要的作用。人尾肢同源蛋白2(human pygopus homolog 2, Pygo2)在肝纖維化進程中發(fā)揮重要作用，有臨床研究證實其血清表達可反映肝纖維化病理分型[6]。Mac-2結合蛋白糖基化異構體(Mac-2 binding protein glycosylation isomer, M2BPGi)是一種廣泛分布于機體組織液、血液中的糖蛋白，其在肝纖維化患者體內呈異常表達狀態(tài)[7]。上述指標均可反映肝纖維化程度，但其聯(lián)合檢測乙肝肝纖維化的研究相對較少，本文對Pygo2、M2BPGi在慢性乙型肝炎肝纖維化患者血清中的表達及聯(lián)合診斷價值進行研究，旨在為臨床研究提供依據。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2016年5月—2019年2月本療養(yǎng)中心收治的慢性乙型肝炎患者345例納入乙肝組，根據肝穿刺活檢病理結果，按肝纖維化分期將乙肝組分成S0組(n=49)、S1組(n=94)、S2組(n=53)、S3組(n=87)及S4組(n=62)。對照組為同期119例正常健康志愿者的血液樣本。本研究經本中心倫理委員會批準，所有研究對象及家屬知情同意。

納入標準：①所有患者均符合慢性乙型肝炎診斷標準[8]，有乙肝疾病史，乙肝表面抗原陽性表達時間>6個月；②接受肝穿刺活檢，并應用2000年《病毒性肝炎防治方案》中擬定的肝纖維化分期標準[9]分組，臨床病理資料齊全。

排除標準：①合并丙型肝炎等其他病毒性肝炎者；②合并患有惡性腫瘤者；③合并患有自身免疫疾病、神經系統(tǒng)或血液系統(tǒng)疾病患者；④酗酒或吸毒者；⑤不配合者。

1.2 肝纖維化病理分期標準

根據中國2000年肝纖維化分期標準[9]：S0期無纖維化；S1期匯管區(qū)纖維化擴大，限局竇周及小葉內纖維化；S2期匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結構保留；S3期纖維間隔伴小葉結構紊亂，無肝硬化；S4期早期肝硬化。

1.3 血清Pygo2和M2BPGi檢測

所有研究對象均于入組時采集空腹外周肘靜脈血4 mL，置于含促凝劑的分離膠黃頭管中，應用Allegray 64R Centrifuge型離心機(美國Beckman Coulter)以3 000 r/min離心10 min，獲得血清分裝，-70 ℃保存，備用。應用全自動酶標儀(美國Thermo Multiskan公司，F(xiàn)C型)酶聯(lián)免疫法測定血清Pygo2和M2BPGi水平，試劑盒來自于上海江萊生物科技有限公司。

1.4 Pygo2和M2BPGi ROC曲線

以肝組織活檢為金標準[9]，繪制血清Pygo2和M2BPGi單獨及聯(lián)合診斷的ROC曲線，同時采用平行聯(lián)合診斷方式，即任一指標為陽性，即可診斷為肝纖維化。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 兩組一般資料的比較

兩組受試者年齡、體質量指數及性別等一般資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05；表1)。與對照組比較，乙肝組谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、Pygo2和M2BPGi水平差異有顯著性(P<0.05)。

表1 兩組一般資料的比較

2.2 各組血清Pygo2和M2BPGi水平的比較

與對照組比較，S0～S4組乙肝患者血清Pygo2和M2BPGi水平均明顯提高(P<0.01；表1)。隨著肝纖維化分期升高，血清Pygo2和M2BPGi水平升高(P<0.01)，且不同肝纖維化分期之間兩兩比較，差異均有顯著性(P<0.01；表2)。

表2 各組患者血清Pygo2和M2BPGi水平的比較

2.3 血清Pygo2和M2BPGi與肝纖維化病理分期的相關性

相關性分析顯示，血清Pygo2、血清M2BPGi與肝纖維化分期均呈正相關(r=0.894,P=0.000；r=0.912,P=0.000)，箱線圖見圖1。

圖1 血清Pygo2和M2BPGi與肝纖維化病理分期相關性箱線圖

2.4 血清Pygo2和M2BPGi回歸分析及臨床診斷價值

分別以血清Pygo2和M2BPGi為自變量，以是否為S1和是否為S2為因變量，行非條件Logistic回歸分析，擬合得到回歸方程分別為logit(PS1)=-0.671+0.873XPygo2+0.892XM2BPGi和logit(PS2)=-0.701+0.873XPygo2+0.887XM2BPGi，結果見表3和表4。

表3 血清Pygo2、M2BPGi與S1分期的Logistic回歸分析

表4 血清Pygo2、M2BPGi與S2分期的Logistic回歸分析

2.5 血清Pygo2和M2BPGi單獨及平行聯(lián)合診斷價值的比較

以血清Pygo2和M2BPGi作為檢驗變量，分別以S1和S2為狀態(tài)標量，以靈敏度為Y軸，以“1-特異度”為X軸分別繪制ROC曲線(圖2)。

圖2 血清Pygo2和M2BPGi單項檢測及聯(lián)合診斷的ROC曲線圖

根據ROC曲線，血清Pygo2診斷S1的AUC為0.826(95%CI 0.774～0.877)。血清M2BPGi診斷S1的AUC為0.784(95%CI 0.758～0.810)。平行聯(lián)合檢測S1的AUC為0.903(95%CI 0.804～0.899)。血清Pygo2診斷S2的AUC為0.829(95%CI 0.779～0.867)；血清M2BPGi診斷S2的AUC為0.793(95%CI 0.763～0.815)。平行聯(lián)合檢測S2的AUC為0.908(95%CI 0.799～0.919)。

平行聯(lián)合檢測靈敏度顯著高于各指標單獨檢測(P<0.05)，且聯(lián)合診斷的AUC顯著高于各項指標單獨檢測(P<0.05)，平行聯(lián)合診斷時，任一指標為陽性，即可診斷為S1或S2(表5和表6)。

表5 Pygo2、M2BPGi單項和聯(lián)合檢測AUC的比較

表6 Pygo2、M2BPGi單項及聯(lián)合檢測診斷價值的比較

3 討 論

流行病學研究顯示，全世界約有2.4億乙肝患者，而其中40%患者會發(fā)展成肝硬化、原發(fā)性肝癌等疾病，嚴重降低患者生命安全[10-11]。文獻[12]研究表明，肝纖維化是病毒侵襲肝細胞所產生的正常修復生理反應，是慢性肝病發(fā)展、惡化成肝硬化和肝癌等疾病的中間病理過程，具有可逆性特點，因而臨床診斷肝纖維化分型對疾病治療和預后恢復有重要的意義。目前臨床上多以影像學、血清學和肝組織活檢等手段診斷肝纖維化程度，彈性超聲等影像學技術具有無創(chuàng)、檢測方便等特點，對肝纖維化分型診斷具有重要意義，但其專業(yè)度高，設備昂貴，患者依從性較低[13]。血清學指標因其具有方便、快捷及無創(chuàng)等特點已在臨床得到廣泛應用。傳統(tǒng)的肝纖維化血清學指標為透明質酸酶、層黏連蛋白、Ⅲ型前膠原氨基末端前肽和Ⅳ型膠原，但其單獨診斷效能較低，而這些指標聯(lián)合診斷較為復雜，且其診斷結果仍需結合其他指標進一步判斷[14]。而血清Pygo2和M2BPGi均與肝纖維化發(fā)生、發(fā)展及惡化有一定的相關性，且有研究證實，其可應用于肝纖維化診斷，且診斷效能較高，但其具體在慢性乙肝患者體內表達及其單獨、聯(lián)合診斷肝纖維化程度的研究相對較少[6,15]。

Pygo2蛋白是臨床新近發(fā)現(xiàn)的Wnt信號通路片段，可在細胞增殖分化、基因轉錄及炎癥反應中發(fā)揮重要作用。當乙肝病毒等侵襲機體肝細胞后，持續(xù)病毒感染會激活機體炎癥反應，進而誘導并激活肝星狀細胞生物學功能，引發(fā)機體肝纖維化病癥的形成[16]。Tokunaga等[17]研究證實，Wnt/β-catenin信號通路在肝星狀細胞的活化和肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關鍵功能，而Pygo2蛋白作為上述通路的關鍵組成結構，可有效調控基因轉錄和表達，進而增強肝星狀細胞表達水平，加重機體肝纖維化病變程度，且朱傳龍等[18]研究表明，血清Pygo2與丙肝肝纖維化程度呈明顯正相關。本文研究表明，隨著肝纖維化的進程，血清Pygo2水平逐步提高，證實血清Pygo2與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展有關，且血清Pygo2與肝纖維化呈正相關。進一步比較其診斷效能發(fā)現(xiàn)，血清Pygo2可有效預測機體肝纖維化，其單獨診斷的靈敏度和特異度仍較低，可能與Pygo2參與細胞增殖分化、基因轉錄過程等有關，因而需聯(lián)合其他因子以提高疾病診斷效能，與文獻[19]研究丙肝患者肝纖維化診斷結果相近。

M2BPGi是一種糖蛋白異構體，可廣泛分布和存在于機體細胞液、組織液及血液中，具有細胞免疫、組成抗原及提高蛋白質親水性等生物學功能[19]。M2BPGi是分泌性糖蛋白，可結合機體半乳凝素、膠原蛋白及纖連蛋白等物質，促進乙肝肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。Sato等[20]研究表明，M2BPGi水平在慢性肝病發(fā)展過程中逐步升高，因而其被臨床用于肝硬化、肝癌等疾病診斷。而肝纖維化病理研究表明[21]，肝星狀細胞可分泌合成M2BPGi，不受其他器官影響，具有良好的肝特異性。本文研究結果表明，隨著肝纖維化的進程，血清M2BPGi水平逐步提高，證實血清M2BPGi與肝纖維化進程有關，且Mark等[15]證實血清M2BPGi表達與肝纖維化進程呈正相關，同時M2BPGi與紫藤多花凝集素特異性結合，共同參與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展及惡化過程。本研究表明，血清M2BPGi與肝纖維化呈正相關，進一步比較其診斷效能發(fā)現(xiàn)，血清M2BPGi可有效診斷機體肝纖維化及其病理進程，與文獻[22]研究丙肝患者肝纖維化診斷效能接近。

血清Pygo2和M2BPGi均是肝纖維化診斷的有效指標，單獨檢測診斷效能偏低，近年來相關研究證實多技術手段或多指標聯(lián)合診斷可提高肝纖維化診斷效能[22-24]，因而本文平行聯(lián)合檢測血清Pygo2和M2BPGi，任一指標為陽性即可判定為存在肝纖維化或明顯纖維化。本研究結果表明，平行聯(lián)合檢測的靈敏度明顯高于各指標單獨檢測，且保持一定的特異度和準確度。同時，本研究應用Logistic回歸綜合分析多項指標，可綜合提高診斷效能。本研究結果基于345例慢性乙型肝炎患者，納入樣本量和樣本來源較為局限，仍需進一步擴充樣本量，納入多研究中心樣本，以驗證結果的可靠性和準確性。

綜上所述，血清Pygo2和M2BPGi二者單獨檢測對肝纖維化臨床診斷具有重要意義，且平行聯(lián)合檢測可提高肝纖維化診斷靈敏度，為肝纖維化早期診斷提供快速、便捷及準確的方法。