TTLL12過(guò)表達(dá)對(duì)口腔鱗癌SCC-25細(xì)胞株生物學(xué)特性的影響

曾 艷，薛伶俐，方 川，程 維，李雅冬

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院頜面外科 400016)

口腔鱗癌是頭頸部腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一[1]。雖然目前臨床治療口腔鱗癌的方法較多，但由于其易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[2-3]，在過(guò)去的幾十年中，存活率仍沒(méi)有得到明顯的提高，且發(fā)病率還在逐年升高[4]。伴隨著腫瘤發(fā)展并對(duì)鄰近組織的侵襲，會(huì)嚴(yán)重影響患者的言語(yǔ)、進(jìn)食、吞咽、呼吸等功能，從而大大降低患者的生存質(zhì)量[5]。因此，臨床迫切需要找到新的有效的治療方法。

眾所周知，癌癥的生物學(xué)基礎(chǔ)是抑癌基因的失活或原癌基因的激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞不受控制的增殖和異常的凋亡，因此，癌癥的發(fā)生和發(fā)展與原癌基因密切有關(guān)[6]。本課題組曾經(jīng)報(bào)道，在頭頸腫瘤中發(fā)現(xiàn)微管蛋白酪氨酸連接酶類似物12(tubulin tyrosine ligase like 12，TTLL12)可通過(guò)阻礙硝基化酪氨酸與微管蛋白的結(jié)合，而促進(jìn)頭頸鱗癌的生長(zhǎng)，具有潛在原癌基因的作用[7]。但目前，對(duì)于TTLL12在細(xì)胞內(nèi)的分布尚不清楚，這為進(jìn)一步深入研究TTLL12的作用機(jī)制造成了不小的障礙，本文將主要闡述近期本課題組的研究成果，以期為口腔鱗癌的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人舌磷癌SCC-25細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供，培養(yǎng)液成分：伊格爾培養(yǎng)基、10%小牛血清、1 mmol/L丙酮酸鈉、40 μg/mL慶大霉素(美國(guó)Sigma公司)。激光共聚焦掃描顯微鏡(德國(guó) Leica)，CF15型低溫離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、Boyden 小室、siRNA及脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(Sigma公司)，內(nèi)參TATA結(jié)合蛋白(TATA-binding protein，TBP)抗體、TTLL12抗體、β微管蛋白(β-tubulin)抗體(美國(guó)Sigma公司)，Na+/K+-ATPase α1抗體(美國(guó)Proteintech公司)，YG-875型超凈工作臺(tái)、CO2孵箱(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1建立TTLL12過(guò)表達(dá)的SCC-25細(xì)胞株

利用慢病毒將TTLL12 cDNAs轉(zhuǎn)染入SCC-25細(xì)胞，篩選穩(wěn)定高表達(dá)TTLL12的細(xì)胞株(過(guò)表達(dá)組)，同時(shí)利用空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入SCC-25細(xì)胞，建立空白對(duì)照組。

1.2.2Western blot

收集細(xì)胞，PBS清洗2遍，加入細(xì)胞裂解液，收集裂解產(chǎn)物，煮沸變性，行蛋白電泳，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，5%的牛奶封閉1 h，依次加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，加二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鼠抗兔IgG抗體，1∶1 000稀釋)，室溫下孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min后，利用DAB顯色試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)并拍照。用美國(guó)BioRad公司Quantity One系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值比值為目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3間接免疫熒光法檢測(cè)

待過(guò)表達(dá)組和空白對(duì)照組SCC-25細(xì)胞爬滿玻片后，棄去培養(yǎng)液，用100%乙醇固定細(xì)胞，然后依次與一抗和二抗孵育60 min。 取出玻璃片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴甘油緩沖液(甘油和pH7.4 PBS液以9∶1體積混合而成)，再覆以蓋玻片。熒光顯微鏡高倍視野下觀察，判定結(jié)果。

1.2.4TTLL12在SCC-25細(xì)胞內(nèi)的分布檢測(cè)

取穩(wěn)定過(guò)表達(dá)TTLL12的SCC-25細(xì)胞株，PBS清洗兩遍，分別提取總細(xì)胞蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白、細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞膜蛋白。加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集裂解后產(chǎn)物，得到總細(xì)胞蛋白。室溫下1 000 r/min離心5 min,棄去上清夜，輕彈管底，將離心管置于冰面，加入600 μL冷bufferA，振蕩15 s，置于冰面15 min，加25 μL 10% NP40，振蕩 5 s，置于冰面10 min，在4 ℃下10 000×g離心5 min，輕輕吸取上清液為細(xì)胞質(zhì)蛋白，PBS清洗2遍，在4 ℃下10 000×g離心5 min，將離心管置于冰面，加100 μL冷bufferC，反復(fù)振蕩，在冰面上靜置40 min，在4 ℃下13 000×g離心20 min，輕輕吸取上清液為細(xì)胞核蛋白，PBS清洗2遍，獲得細(xì)胞核膜蛋白。利用各組蛋白進(jìn)行Western檢測(cè)TTLL12的分布。

1.2.5沉默TTLL12在SCC-25細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

將1×105/mL濃度的SCC-25細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，加伊格爾培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%時(shí)，進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。參照LipofectamineTM2000試劑說(shuō)明操作，干擾組siTTLL12序列:5′-GGU UGU UCG UGU AUG AUG U-3′，轉(zhuǎn)染空白對(duì)照序列的為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞，利用Western blot檢測(cè)TTLL12的表達(dá)情況。

1.2.6四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將干擾組與對(duì)照組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種到96孔培養(yǎng)板內(nèi)，使每孔細(xì)胞數(shù)為2 000個(gè)，在37 ℃的CO2孵箱中孵育，每24小時(shí)檢測(cè)1次，共9 d，檢測(cè)前在每個(gè)孔內(nèi)加入MTT(5 mg/mL)10 μL，放入CO2孵箱中孵育4 h，去上清液，每孔加入二甲基亞砜與0.04 mol/L鹽酸的混合物150 μL，震蕩1 h后，再利用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處比色，每次檢測(cè)至少6個(gè)孔，最后取其平均值。

1.2.7Boyden小室侵襲試驗(yàn)

將Boyden小室放入每孔加有500 μL含10%胎牛血清的6孔培養(yǎng)板中，Boyden小室中加入500 μL不含胎牛血清的培養(yǎng)基，取濃度為4×105/mL的各組細(xì)胞懸液200 μL加入Boyden小室，37 ℃孵育4 h后，取出Boyden小室，濾膜下層向上，PBS洗滌，3%戊二醛固定，蘇木素染色，用棉花棒擦凈小室濾膜上層未侵襲的細(xì)胞。使用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照，計(jì)算出穿過(guò)濾膜的細(xì)胞百分比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 TTLL12在SCC-25細(xì)胞的表達(dá)分析

經(jīng)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)組TTLL12相對(duì)表達(dá)水平較空白對(duì)照組明顯增強(qiáng)，證明TTLL12穩(wěn)定高表達(dá)的SCC-25細(xì)胞株成功建立，見圖1。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)組SCC-25細(xì)胞內(nèi)有亮紅色熒光，分布于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和細(xì)胞核膜，而空白對(duì)照組SCC-25細(xì)胞內(nèi)僅有較暗、較淺的紅色熒光，見圖2。間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果還顯示TTLL12與α-tubulin的分布重合，見圖3。

圖1 Western blot檢測(cè)TTLL12在SCC-25細(xì)胞的表達(dá)

2.2 TTLL12在細(xì)胞內(nèi)的分布

Western blot結(jié)果顯示在細(xì)胞總蛋白中，TTLL12、β-tubulin、TBP和Na+/K+-ATPase α1均有條帶顯示；在細(xì)胞質(zhì)蛋白中，TTLL12和β-tubulin有條帶顯示；在細(xì)胞核蛋白中，TTLL12和TBP有條帶顯示；在細(xì)胞核膜蛋白中，TTLL12和Na+/K+-ATPase α1有條帶顯示，見圖4。

A:空白對(duì)照組；B:過(guò)表達(dá)組。

2.3 干擾TTLL12在SCC-25細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

利用siRNA沉默TTLL12的表達(dá)，經(jīng)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示干擾組TTLL12蛋白較對(duì)照組降低，見圖5。

A:細(xì)胞核;B:α-tubulin;C:TTLL12;D:重合。

圖4 Western blot檢測(cè)TTLL12在SCC-25細(xì)胞中的分布

圖5 干擾TTLL12在SCC-25細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

2.4 干擾TTLL12對(duì)SCC-25細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

MTT法檢測(cè)SCC-25細(xì)胞生長(zhǎng)的情況，結(jié)果表明，干擾組SCC-25細(xì)胞的生長(zhǎng)較對(duì)照組受到明顯抑制(P<0.05)，見圖6。

圖6 SCC-25生長(zhǎng)曲線

2.5 干擾TTLL12對(duì)SCC-25細(xì)胞侵襲的影響

Boyden小室侵襲試驗(yàn)結(jié)果表明，干擾組穿過(guò)濾膜的細(xì)胞百分比為(31±2)%，對(duì)照組穿過(guò)濾膜的細(xì)胞百分比是(56±5)%，干擾組SCC-25細(xì)胞穿過(guò)濾膜的細(xì)胞百分比較對(duì)照組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖7。

圖7 Boyden小室侵襲試驗(yàn)

3 討 論

口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)逐級(jí)進(jìn)行的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，其中，原癌基因的過(guò)表達(dá)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色[8]。筆者曾經(jīng)報(bào)道在頭頸鱗癌中，TTLL12具有潛在原癌基因的作用[7]。近年，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)TTLL12在肺腺癌、結(jié)腸腺癌、直腸腺癌、前列腺癌和肺癌中表達(dá)明顯升高，并與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)(P<0.05)[9-12]。還有一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)TTLL12與人體免疫有關(guān)，例如PENG等[13]發(fā)現(xiàn)，和HIV陰性的健康人比較，TTLL12在HIV陽(yáng)性患者中的表達(dá)升高，表明TTLL12可能與先天免疫調(diào)節(jié)，免疫缺陷綜合征的疾病進(jìn)展和HIV-1復(fù)制相關(guān)。JU等[14]發(fā)現(xiàn)TTLL12可以抑制抗病毒的RIG-I通路活性，從而增強(qiáng)RNA病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力，LORENZ等[15]發(fā)現(xiàn)在發(fā)生急性閉角型青光眼后的0～12周，TTLL12在患者的血清中的表達(dá)呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)。

根據(jù)目前的研究成果可知，TTLL12具有SET和TTL結(jié)構(gòu)域，而TTLL12的TTL結(jié)構(gòu)域缺少其他家族成員所保留的7個(gè)基序中的3個(gè)。TTLL12的TTL結(jié)構(gòu)域可能與TTLL12參與微管修飾功能有關(guān)[16-17]。有研究認(rèn)為在真核細(xì)胞的進(jìn)化過(guò)程中，TTLL12的SET結(jié)構(gòu)域可能對(duì)異染色質(zhì)和常染色質(zhì)的形成起到非常重要的作用[18]。另外，TTLL12高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致H4K20表達(dá)升高，很可能與TTLL12的SET結(jié)構(gòu)域有關(guān)[17,19]。但TTLL12在細(xì)胞內(nèi)的分布及生物學(xué)功能尚不清楚。

了解和掌握TTLL12在細(xì)胞中的分布，對(duì)進(jìn)一步研究TTLL12的功能至關(guān)重要，因此，本研究利用間接免疫熒光法和Western blot率先證實(shí)TTLL12主要分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及細(xì)胞核膜，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的α-微管蛋白與TTLL12的分布一致，這一結(jié)果很好地解釋了TTLL12的已知功能。筆者前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)TTLL12會(huì)干擾硝基化酪氨酸與微管蛋白的結(jié)合。在真核細(xì)胞中，α-tubulin主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，參與形成細(xì)胞骨架、維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞移動(dòng)、細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)的運(yùn)輸及細(xì)胞的分裂等，與細(xì)胞的正常生命活動(dòng)密切相關(guān)。硝基化酪氨酸與α-tubulin結(jié)合，形成硝基化酪氨酸微管蛋白，影響微管的功能，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。TTLL12可能利用TTL結(jié)構(gòu)域的微管蛋白酪氨酸連接酶活性，與細(xì)胞質(zhì)中的α-tubulin結(jié)合，從而阻礙了硝基化酪氨酸與α-tubulin的結(jié)合，最終促進(jìn)頭頸鱗癌的生長(zhǎng)[7]。分布在細(xì)胞核和細(xì)胞核膜的TTLL12很可能與染色體數(shù)量明顯增多[17]，H4K20表達(dá)升高[19]，HIV-1復(fù)制[13]有關(guān)，而這些功能很可能與TTLL12的SET結(jié)構(gòu)域有關(guān)。由此可見，搞清楚了TTLL12的分布，可以更好地理解TTLL12的各種功能，同時(shí)也為下一步研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

另外，在沉默TTLL12的表達(dá)后，本研究利用MTT試驗(yàn)和Boyden小室侵襲試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲能力的變化，結(jié)果表明沉默TTLL12會(huì)導(dǎo)致SCC-25細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，侵襲能力變?nèi)酢＿@說(shuō)明沉默TTLL12可有效抑制SCC-25細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，其原因可能是，沉默TTLL12后，阻斷了TTLL12對(duì)微管的影響作用。微管與細(xì)胞周期和細(xì)胞移動(dòng)密切相關(guān)[20-21]，在細(xì)胞間期時(shí)，α-tubulin聚合形成微管，形成細(xì)胞內(nèi)的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入分裂期時(shí)，核膜分解，α-tubulin解聚，然后重新聚合形成紡錘體，并引導(dǎo)染色體運(yùn)動(dòng)，在分裂末期，紡錘體又會(huì)發(fā)生解聚，重新形成細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，核膜重新形成。當(dāng)細(xì)胞移動(dòng)時(shí)，會(huì)發(fā)生形狀改變，偽足形成，這些都需要微管的參與[22]。在沉默TTLL12后，TTLL12對(duì)微管的作用也會(huì)消失，從而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，侵襲能力變?nèi)酢TLL12在核膜也有分布，這或許影響了有絲分裂時(shí)的核膜分解和形成。但其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，TTLL12分布于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及細(xì)胞核膜。由于其分布較廣，TTLL12很可能還有一些其他功能尚未發(fā)現(xiàn)，需進(jìn)一步研究。沉默TTLL12會(huì)導(dǎo)致SCC-25細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，侵襲能力變?nèi)酢Ｒ虼耍琓TLL12有望作為治療口腔鱗癌的靶點(diǎn)之一。