全反式維A酸對肺腺癌H1299細胞放射敏感性研究

孫 謙，宣愛麗，汪庚明，周詠春，徐洪波，何澤來，周 燕，周育夫，江 浩

2015年世界衛生組織統計，癌癥是91個國家70歲前人群的主要死亡原因。全球癌癥的發病率及死亡率呈迅速增長之態。目前全世界肺癌的發病率(11.6%)及死亡率(18.4%)均排第一位[1]，是對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。目前對中晚期肺癌治療主要采取綜合治療，放療是肺癌綜合治療中重要的治療方法之一。在不同期別肺癌中均可應用放療，但總體治療效果較差，治療失敗主要原因是局部未控及遠處轉移。非小細胞肺癌尤其是腺癌對放療不敏感，為提高放療敏感性，放射增敏劑是有效解決該難題的重要方法之一。

研究[2-3]發現全反式維A酸(all-trans retinoic acid，ATRA)作為維生素A的主要代謝產物，主要參與調控細胞的增殖分化，誘導腫瘤細胞凋亡，是一種誘導分化劑。研究[4]發現ATRA能夠增加胃癌細胞的凋亡及放射敏感性，可能與抑制細胞周期G2/M期的阻滯作用、下調Bcl-2與survivin mRNA表達、上調NF-κB與Bax mRNA表達有關。李明等[5]研究發現ATRA聯合放療具有協同誘導腦膠質瘤細胞凋亡的作用，其分子機制可能與凋亡相關基因p38及MAPK蛋白表達上調、NF-κB蛋白表達下調有關。本研究探討ATRA對肺腺癌細胞株H1299放射敏感性的影響，為肺癌放射增敏提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 肺腺癌H1299細胞購買于ATCC細胞庫。RPMI 1640培養基、胎牛血清購自HyClone公司，ATRA、MTT試劑盒購自Sigma公司，細胞周期試劑盒及細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司，survivin、NF-κB、GAPDH抗體購自Anbo公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購自北京中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 肺腺癌H1299細胞培養于含10%胎牛血清及雙抗的RPMI 1640培養基中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。當細胞生長至80%融合時，加入0.25%胰蛋白酶消化進行傳代，取對數生長期的細胞進行后續實驗。

1.2.2 MTT法檢測ATRA及射線照射對肺腺癌H1299細胞存活率的影響 取對數生長期的H1299細胞，調整細胞密度為104/mL，接種于96孔板中，每孔200 μL，貼壁后，分別加入終濃度為0(對照組)、0.1、0.25、0.5、1.25、2.5、5、10 μmol/L的ATRA，每組6個復孔，繼續培養24、48、72 h，加入20 μL MTT試劑，繼續培養4 h，用酶聯免疫檢測儀測490 nm處檢測吸光度(A)，細胞生長抑制率=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。根據ATRA對H1299細胞增殖抑制的結果，選擇合適的刺激濃度，考察ATRA聯合射線照射和單獨ATRA相比，抑制H1299細胞增殖的效果。

1.2.3 平板克隆形成實驗 將處于對數生長期的H1299細胞，接種于60 mm的培養皿中，每皿約150個細胞的濃度，實驗分2組：(1)放射組給予不同劑量X射線照射；(2)ATRA+放射組以10 μmol/L ATRA處理24 h后給予不同劑量X射線照射。使用6 mV的X線照射，照射劑量分別為0、2、4、6、8 Gy，將培養皿置于20 cm×20 cm照射野內，源皮距為100 cm。照射后，更換無藥培養液繼續培養14 d。用無水乙醇固定，結晶紫染色，計數克隆數及放射敏感性參數D0、Dq及N值。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡和細胞周期 實驗分為4組：對照組、ATRA組(2 μmol/L)、2 Gy照射組及ATRA(2 μmol/L)+2 Gy照射組，將4組細胞處理后更換無藥培養液培養24 h后制備單細胞懸液，細胞凋亡及細胞周期分分布情況，分別經AnnexinV-PE/7-AAD雙染和PI單染后上機檢測。

1.2.5 Western blotting檢測各組細胞survivin與NF-κB蛋白表達 實驗分3組：對照組、2 Gy照射組及ATRA(2 μmol/L)+2 Gy照射組，操作按文獻[5]進行，用quantity one軟件分析各組光密度值。蛋白相對表達量=目的蛋白光密度值/相應內參GAPDH光密度值。

1.3 統計學方法 采用t檢驗、方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 MTT法檢測ATRA及射線照射對肺腺癌H1299細胞存活率的影響 不同濃度ATRA對肺腺癌H1299細胞均有抑制作用，濃度為10 μmol/L時最佳(P<0.01)，72 h時其抑制率達到最大值(見表1)。相對單獨ATRA處理，10 μmol/L ATRA聯合不同劑量的射線照射后，細胞生長抑制率明顯增加(P<0.01)(見表2)。

2.2 ATRA及ATRA聯合射線照射誘導H1299細胞凋亡 ATRA作用和射線照射后的細胞凋亡增多(P<0.01)，ATRA聯合射線照射作用后的細胞總凋亡率明顯高于單純射線照射(P<0.01)(見圖1、表3)。

2.3 ATRA及ATRA聯合射線照射對H1299細胞周期的影響 與對照組、放射組、ATRA組相比，ATRA+放射組細胞G0/G1期比例明顯增加(P<0.01)(見表4)。

2.4 ATRA對H1299細胞放射敏感性影響 與放射組相比，ATRA+放射組的細胞存活分數(SF2)值降低，ATRA可以增加肺腺癌H1299細胞放射敏感性，增敏比為1.406(見表5)。

2.5 各組H1299細胞中survivin與NF-κB的蛋白表達情況 對照組、放射組、ATRA+放射組細胞中survivin與NF-κB的蛋白表達水平呈下降的趨勢，且ATRP+放射組細胞中survivin與NF-κB的蛋白表達水平明顯低于對照組和放射組(P<0.01)(見圖2、表6)。

表1 ATRA抑制H1299細胞生長

表2 射線單獨照射和10 μmol/L ATRA聯合射線照射對H1299細胞存活的影響

3 討論

放射治療在肺癌的根治性和姑息性治療中均起關鍵作用。在局部晚期[6]和早期[7]非小細胞肺癌中均得到證實。但肺癌總體預后較差，治療失敗主要原因局部未控及遠處轉移。在局部晚期非小細胞肺癌中經放射治療后多數腫塊無法完全消失，為提高腫瘤局部控制率,近年來關于如何增加放射敏感性研究越來越多。

表3 ATRA及ATRA聯合射線照射誘導H1299細胞凋亡情況

研究[8-10]發現ATRA可以促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成及轉移，增加化療藥物敏感性[10]。王艷萍等[4]研究發現ATRA能夠增加胃癌細胞SGC-7901的凋亡及放射敏感性，在肺腺癌H1299細胞中是否存在放射增敏作用，目前尚未發現相關研究結果。本研究通過MTT法、平板克隆形成實驗、流式細胞術方法研究ATRA對肺腺癌H1299細胞存活率、放射敏感性、細胞周期的作用；同時應用Western blotting檢測細胞中survivin與NF-κB的蛋白表達情況。結果顯示，與放射組相比，ATRA+放射組細胞survivin與NF-κB蛋白表達被明顯抑制。平板克隆形成實驗也顯示，ATRA+放射組的D0、Dq、N及SF2均明顯低于放射組，表明放療敏感性增強。細胞周期實驗結果顯示，與對照組、放射組、ATRA組相比，ATRA+放射組G0/G1期比例明顯增加，與研究[11]結果相符。研究[12]發現survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，具有腫瘤特異性，只表達于腫瘤和胚胎組織，且與腫瘤細胞的分化增殖及浸潤轉移密切相關。SANDUR等[13]研究發現在結直腸癌細胞中放療增加NF-κB表達，出現放療抵抗，加入姜黃素后NF-κB表達明顯下降，放射敏感性明顯增加。李曉波等[14]在肺癌細胞中也得到相同結果。李明等[5]應用替莫唑胺、ATRA聯合放療抗腦膠質瘤U251細胞研究發現，聯合組細胞凋亡數明顯增高，聯合組與對照組、放療組及藥物組比較p38MAPK表達明顯上調，聯合組與對照組、放射組及藥物組比較，NF-κB表達明顯下調。本研究結果顯示，與對照組及放射組相比，ATRA+放射組細胞中survivin與NF-κB的蛋白表達量均明顯降低，提示ATRA可能通過下調survivin與NF-κB表達增加H1299細胞放射敏感性。

表4 ATRA及ATRA聯合射線照射對H1299細胞周期的影響

表5 ATRA對H1299細胞放射敏感性影響

表6 各組H1299細胞survivin與NF-κB的蛋白表達情況

綜上所述，ATRA對肺腺癌H1299細胞具有放射增敏作用，其機制可能與ATRA直接抑制H1299細胞增殖、促進H1299細胞凋亡，下調survivin及NF-κB蛋白表達有關。