乙型肝炎表面抗原（HBsAg）酶聯免疫吸附試驗檢測灰區設置的探討

字立源，黃蘇金，陳桂余，楊婧涓,蘭曉燕，尹瀟, 胡付娟,朱碧姝，楊雪，朱榮華

云南保山市中心血站檢驗科，云南保山 678000

我國是HBV 的高流行地區約占總傳染病總數的1/3，我國的 HBV 人群感染率(HBsAg 陽性率 7.18%)。HBsAg 為HBV 感染的最主要指標，是采供血機構保障血液安全必檢項目之一，盡管隨著科學技術的發展，檢測方法、檢測技術均有所提高，減低了因輸血傳播疾病的風險，但輸血傳播乙肝病毒（HBV）的風險仍然是血液安全面臨的巨大挑戰。目前檢測HBsAg 的主要方法是酶聯免疫吸附試驗（ELISA），簡便、快速、特異、成本低、且靈敏度較高。特別適用于大批量獻血者篩查及健康體檢。由于窗口期的世界性難題，該站采用兩個廠家酶聯免疫吸附試驗試劑進行兩遍檢測，酶免檢測無反應性標本，再進行1 遍核酸檢測。對弱反應性標本設置灰區，灰區范圍為（0.5≤S/CO＜1）?；覅^的設置一直是采供血機構檢測實驗室討論的熱點問題，既要保障血液安全，又不能讓無辜的獻血者淘汰，避免血液的浪費。該中心血站2016 年1 月—2017年6 月以無償獻血者標本27 214 份為樣本，對灰區的設置進行相關分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

該中心血站對無償獻血者標本27 214 份，酶免采用HBsAg 酶聯免疫吸附試劑盒A 和B 兩個廠家，該實驗室兩試劑均設有灰區，0.5≤S/CO＜1,雙試劑有反應性，則報告有反應性；單試劑有反應性，雙孔復查，復查只要其中一孔有反應性，則報告有反應性，兩孔均為無反應性，則報告無反應性。報告為反應性標本。所有檢驗標本均同時進行HBV-DNA 檢測，委托第三方血站采用諾華檢測系統進行檢測。

1.2 試劑

HBsAg 酶聯免疫吸附試劑盒A 試劑，HBsAg 酶聯免疫吸附試劑盒B 試劑。

1.3 結果判定

S/CO≥1 判定為陽性，0.5≤S/CO<1 判定為可疑（灰區），S/CO<0.5 判定為陰性。HBV-DNA 檢測有反應性為補充實驗的確證標準。

1.4 儀器

全自動酶免分析系統一體機(Uranus AE150)。EVO-150 全自動加樣儀，FAME16/20 全自動酶標儀。

1.5 統計方法

采用SPSS 17.0 統計學軟件分析數據。

2 結果

2.1 檢測結果

共檢測27 214 份血液標本，結果見表1。

表1 ELISA 法檢測乙肝表面抗原和核酸檢測情況

2.2 兩試劑ROC 曲線下面積分析

兩試劑ROC 曲線下面積結果見表2。

表2 A、B 試劑在不同臨界值下ROC 曲線下面積

2.3 試劑A 和試劑B 敏感性和特異性

臨界值 （Cut off）S/CO 為 0.5、0.8、0.9、1.0、1.6 時,越接近左上角的曲線，方法學的敏感性和特異性越好，試劑A 優于試劑B。臨界值的確定，最接近左上角的切點值（Cut off）是最佳分界值，敏感性與特異性之和最大。所該實驗室臨界值（Cut off）S/CO 為 0.9 最佳分界值。

3 討論

乙型肝炎病毒感染的最直接證據是檢測其病原標志HBsAg 。HBsAg 作為必檢項目之一,常用ELISA方法,該方法以Cut off 值作為判定陰性或陽性結果的分界線標準，受方法學的限制，出現一些接近臨界值結果，通常把這一段結果定為“灰區”，為了防止弱陽性標本漏檢，確保輸血安全，防止HBV 感染，很多實驗設立了“灰區”。血液篩查實驗室是否應設置灰區、如何設置灰區還存在一定爭議[1]。

核酸檢測方法是目前血液篩查已經比較成熟的檢測方法，可檢出血液中較低水平的HBV 病毒，且對于HBV 病毒的隱匿性感染、 病毒亞型和病毒變異也能檢出[2-3]。這樣的檢測數據,反映ELISA 檢測灰區標本和單試劑有反應性標本的絕大部分獻血者不是正真的HBV 病毒感染者, 該血站對ELISA 方法檢測的“灰區”試驗結果報告為“有反應性”，并對有反應性”血液作報廢處理，對相應的獻血員作永久屏蔽。這種做法對輸血安全確實有積極作用，但造成血液資源的浪費[4-5]。

從ROC 曲線下的面積評價試劑敏感性和特異性，臨界值在 0.5、0.8、0.9 時，A、B 試劑 ROC 曲線下面積相同，A 試劑面積為0.845,B 試劑面積為0.837，說明該實驗室準確性較好。臨界值S/CO 為1 時，A、B試劑ROC 曲線下面積有所改變。ROC 曲線能兼顧到被評估方法在所有臨界值的靈敏度和特異性，曲線下面積（AUC）就越大，表示該方法的靈敏度和特異度就越高，準確性就越高，診斷價值就越大[6]。該實驗室通過比較臨界值 S/CO 為 0.5、0.8、0.9、1.0、1.6，5 個臨界值ROC 曲線下面積，可知臨界值 S/CO 為0.9 時，該實驗室檢測結果靈敏度和特異度就最高，準確性就最高，診斷價值就最大。

Youden 指數 （Youden 指數=靈敏度+特異度-1）是用來評價檢篩試驗真實性的指標，試劑A 和試劑B最佳臨界值（Cut off）為（S/CO 值）0.9，作為檢測結果判定值。該實驗室以為（S/CO 值）0.5 作為檢測結果判定值，低于最佳臨界值（Cut off）為（S/CO 值）0.9。試劑A 和試劑 B 廠商推薦的臨界值為（S/CO 值）1.0，高于最佳臨界值0.9。通過對該實驗室A、B 兩試劑的比較，試劑A 在敏感性和特異性方面均優于試劑B，敏感性和特異性是診斷方法學評價的重要指標，二者相互矛盾又相互聯系。該實驗室采用兩種檢測試劑，在選擇試劑檢測策略時，兩種試劑最好互補。通過該實驗室檢測數據的分析研究，該實驗室最佳臨界值（Cut off）為應設置（S/CO 值）0.9，這樣即保障檢測結果的準確性，又可減少血液不必要的浪費和防止獻血者的流失。雖然全國血站實行核酸檢測，但各實驗室檢測能力參差不齊[7-8]。隨著檢測技術的提高，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測灰區的設置，進行核酸檢測和確證試驗后，尋找適合該實驗室的最佳臨界值。