發酵法生產利普司他汀的研究進展

李玲，于泳，胡永紅

（1 東南大學成賢學院制藥與化學工程學院，江蘇南京210088；2 南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211816）

利普司他汀，分子式為C29H49NO5，分子量491.708，CAS 編號96829-59-3，化學名為(2S,3S,5S,7Z,10Z)-5-[(S)-2-甲酰胺基-4-甲基戊酰氧基]-2-己基-3-羥基-7,10-十六二烯酸內酯，淡黃色油狀液體，幾乎不溶于水，易溶于甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷。該化合物含一個β-內酯環、兩個鏈長為6 個碳和13 個碳的脂肪族側鏈，13 個碳側鏈包含兩個獨立的雙鍵和一個羥基酯化成N-甲酰亮氨酸（結構如圖1）[1-2]。

圖1 利普司他汀和THL的化學結構式

1 利普司他汀及其四氫衍生物臨床應用概述

利普司他汀能選擇性抑制腸道中的胰脂肪酶活性，減少脂肪的水解和吸收，其活性中心為化合物結構中的β-內酯環[2]，但其結構中13碳原子的長鏈含有兩個獨立雙鍵，該雙鍵的存在導致其穩定性較差。瑞士羅氏（Roche）公司將利普司他汀中兩個雙鍵催化加氫， 得到四氫利普司他汀（tetrahydrolipstatin，THL，結構式如圖1），即奧利司他（orlistat），于1998 年被美國食品藥品監督管理局（FDA）批準作為治療肥胖癥藥物上市，是目前上市的唯一非中樞神經系統藥物[3-4]，現在全球主要地區都已上市。該藥物不同于作用于神經傳導物質的傳統減肥藥，無頭暈、心悸等不良反應。在膽汁鹽的參與下，利普司他汀和胰脂肪酶結合，通過活性部位絲氨酸殘基酰化來抑制胰脂肪酶的催化活性，從而降低消化道中脂肪的消化和吸收，該情況下腸道內持續處于油相狀態，膽固醇同時也被隔離出來，阻斷食物中約30%脂肪的水解和吸收，從而達到控制體重的目的[5-6]。

奧利司他在降“三高”（降血脂、降血糖、降血壓）方面療效顯著。臨床研究表明，服用奧利司他能有效降低血液中總膽固醇、降低LDL/HDL（低密度脂蛋白膽固醇/高密度脂蛋白膽固醇）比例以及LDL、甘油三酯的水平，還可以降低空腹時的血糖和胰島素水平，改善血糖耐受性，增加胰島素敏感性，減少低血糖治療的需求，另外還可以降低血壓，縮小腰圍[7-8]，能較好地控制或預防高脂血癥、代謝綜合征、動脈粥樣硬化等疾病[9]。

奧利司他為抗腫瘤治療提供了新思路。脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）是脂肪酸合成中的關鍵酶，同時在胚胎發育、肥胖癥和癌癥生物學等領域具有重要功能[10]。Agostini 等[11-12]研究發現，乳腺癌、前列腺癌、口腔癌、肝細胞癌、軟組織肉瘤等多種惡性腫瘤中都具有FAS過度表達，這種高度表達與腫瘤的產生、惡化相關。故如能選擇性抑制該酶的活性，將會有效遏制惡性腫瘤細胞的蔓延。Knowles 等[13]利用奧利司他抑制乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-435 和前列腺癌PC-3、LNCaP細胞中FAS 活性，效果顯著，導致caspase-8 介導的腫瘤細胞凋亡。Kant等[14]研究發現奧利司他能強效抑制T 細胞淋巴瘤細胞中Bcl-2、HSP-70 表達，導致細胞中活性氧、細胞色素等代謝異常，從而促進腫瘤細胞凋亡。國內學者臨床研究發現奧利司他能誘導口腔癌HSC-3 細胞凋亡及細胞周期阻滯[15]，還有報道顯示對非酒精性脂肪性肝病相關的肝細胞癌的治療效果顯著[16]。

其他應用，如Hahn等[17]研究發現服用奧利司他能抑制寄生蟲脂肪酶的代謝，如抑制賈第鞭毛蟲，腸道里面的寄生蟲。吳寶等[18]將奧利司他與瑞舒伐他汀聯合治療單純性肥胖伴高脂血癥患者安全有效，其減輕體重和改善血脂的效果優于瑞舒伐他汀，且不增加肝腎功能損傷、肌痛風險。近日有學者研究表明，奧利司他除了具有減肥的藥理作用外，還可以抑制睪丸氧化應激、炎癥和細胞凋亡[19]。

奧利司他不良反應表現為可抑制某些需要羧基酯酶完成的脂溶性維生素（維生素A、D、E、K）的水解和吸收，因此建議在服藥時補充脂溶性維生素[20]。在長達兩年、數千名患者多項隨機、雙盲和安慰劑對照臨床試驗的結果表明，奧利司他除一些胃腸道的不良反應外，總體耐受性良好。常見胃腸道反應發生率約26%，主要表現為胃腸道排氣增多、脂肪(油)性大便、大便次數增多和大便失禁[21]。

2 發酵法生產利普司他汀的現狀

近年來國內外主要選用毒三素鏈毒菌（S. toxytricini）生產利普司他汀。Paul 等[22]的專利最早公布了利普司他汀的發酵生產工藝、提取方法，S.toxytriciniNRRL 15443最高發酵效價為6.23mg/L。瑞士羅氏（Roche）公司對毒三素鏈毒菌進行了誘變選育，隨后對利普司他汀進行催化加氫生成四氫衍生物奧利司他，優化了發酵、提取、精制工藝[1-2]，同時臨床研究取得成功，實現了奧利司他工業化生產[4]。利普司他汀生產效率的提高主要取決于高產菌株的選育和發酵工藝條件優化（含培養基和培養條件），這兩方面是相輔相成。Varga等[23]優化了毒三素鏈毒菌CCM7349 發酵生產利普司他汀的工藝過程，該工藝采用70L 發酵罐補料發酵，約34h時開始補加亞油酸、L-亮氨酸混合溶液，發酵終止效價達3290mg/L。Gasparic 等[24]改良了種子培養基發酵工藝，補料培養基中添加0.3%亞油酸、1%豆油，最優培養條件下培養144h，效價由未補料時的556mg/L 提升至4773mg/L。Fujs 等[25]公布了毒三素鏈霉菌突變菌株補料發酵工藝，接種20h后補加亞油酸和L-亮氨酸，控制亞油酸體積分數0.3%～0.5%，發酵結束時利普司他汀的發酵效價達4400mg/L。實驗條件優化協同數學相關軟件工具能顯著提高實驗效率，如Kumar 等[26]對菌株S. toxytriciniNRRL 15443 的發酵培養基采用Plackett-Burman 設計優化提高利普司他汀效價至1980mg/L。Luthra 團隊[27-28]對菌株S.toxytriciniATCC 19813 進行UV 和NTG 聯合誘變，隨后采用全因子試驗設計優化發酵培養條件，發酵培養添加大豆粉35g/L 和豆油25g/L 的條件下利普司他汀效價高達3290mg/L。Kumar 等[29-30]在發酵培養基中添加非常規碳源和調節利普司他汀三羧酸循環（TCA）促進產物合成，結果發現碳氮比2∶3時，添加豆粉40g/L、芝麻油30mL/L、亮氨酸、煙酸、硫胺酸、TCA 循環中間產物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和琥珀酸均能有效提高利普司他汀效價，驗證試驗最終效價提升了2.45 倍，高達2242.63mg/L；同時對毒三素鏈霉菌菌絲球形成影響因素，發酵動力學參數進行了研究；該研究團隊還采用紫外、甲磺酸乙酯、甲基甲烷磺酸鹽和NTG 復合誘變技術結合前體物補充，提升效價至2387mg/L[31]。Khushboo等[32]采用N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍（NTG）和γ射線復合誘變選育并對發酵條件、脂肪酸前體添加進行優化，利普司他汀最高產量為5886mg/L。

上海師范大學王棟海[33]最早通過紫外和微波復合誘變處理毒三素鏈霉菌菌株，并對其進行培養條件優化研究，發酵效價達663mg/L。浙江工業大學韓俊茹等[34]通過相同的誘變手段得到毒三素鏈霉菌突變菌株XC-lp-69，并對其進行條件優化確定了補料發酵工藝，效價達1400mg/L；隨后該團隊對誘變菌株zjut011 采用單因素試驗和正交試驗法進行了優化，發現L-亮氨酸是最適合lipstatin生物合成的前體，并首次發現二價陽離子Mg2+、Co2+和Zn2+對提高lipstatin 發酵效價有顯著作用，確定了最佳工藝條件為：L-亮氨酸45.72mmol/L，辛酸31.1985mmol/L （第6 天添加），Mg2+12mmol/L，Co2+1mmol/L，Zn2+0.25mmol/L，優化后效價高達4208mg/L[35]。王永青[36]采用正交實驗法優化了培養條件，并確定了補料培養工藝，于發酵培養36h開始補料，控制亞油酸/辛酸（2∶1）0.35g/(L·h)、L-亮氨酸（8%）0.4g/(L·h)；發酵培養72h補加4%的豆油。孫菲[37]研究了溶氧和剪切力對毒三素鏈霉菌發酵產生利普司他汀的影響，采用10L發酵罐補料工藝發酵效價達到6446mg/L。上海醫藥工業研究院黃娟等[38]通過紫外-微波復合誘變，突變菌株效價比原始菌株提高3.25倍。劉順娜等[39]采用紫外和亞硝基胍誘變，獲得一株高產突變株，選用葵花籽油作為前體和碳源，并對其進行Box-Behnken中心組合設計優化發酵培養條件，最終發酵效價高達8122.9mg/L。福建省微生物研究所陳洲琴等[40]采用單因素-正交設計實驗相結合的方法，優化S.toxytriciniFIM-17-16 發酵培養基和發酵參數，發酵周期短產量高，最高效價達9667mg/L。

以上研究表明，紫外、γ射線、NTG等誘變手段結合數學軟件指導的培養條件優化能大幅提升利普司他汀的產量，前體化合物L-亮氨酸、長鏈不飽和脂肪酸亞油酸的添加也能顯著提高利普司他汀效價，另外還發現二價金屬陽離子影響效果顯著，如表1所示。

3 利普司他汀代謝途徑和生物合成機制

鏈霉菌具有完善的代謝和分泌系統，最為顯著的特征是具有豐富的次生代謝途徑，而初生代謝和次生代謝之間具有嚴密的調控體系，目前臨床上比較有價值的抗生素幾乎都來源于鏈霉菌屬。毒三素鏈霉菌合成利普司他汀確切的代謝途徑和分子機制至今仍未完全闡釋清楚。Eisenreich 等[41]研究了毒三素鏈霉菌合成利普司他汀，起始于C8和C14脂肪酸的Claisen 縮合反應。德國科技大學和羅氏公司對利普司他汀的生物合成機理做了大量研究。Adelbert 等[43-44]運用同位素示綜法，用13C 標記培養基中的油脂，采用核磁共振（NMR）法檢測，結果排除了利用乙酸等小分子合成利普司他汀烴基鏈，而是由長鏈油脂代謝轉化而得到[42]。C14部分的唯一來源是培養基中的不飽和脂肪酸，而氫化后的飽和13C-油脂代謝得到C8碳部分和亮氨酸部分，故亞油酸在利普司他汀C14烴基前體的生成過程中有非常重要的作用。基于以上文獻結果，推測利普司他汀生物合成路徑如圖2，亞油酸活化生成亞油酸輔酶A，經過兩次β氧化（每次降解2 個碳原子）得到十四烷-5,8-二甲酰輔酶A，和辛酸路徑形成的己基丙二酰輔酶A Claisen 縮合形成3-氧代中間體，該中間體經過羥基化與N-甲酰-L-亮氨酸反應合成利普司他汀。Demirev 等[45-46]通過分子生物學研究發現酰基輔酶A 羧化酶（ACCase）復合物（圖3）通過催化活化有機酸參與脂肪酸和聚酮類化合物參與了利普司他汀的生物合成，并報道了毒三素鏈霉菌中酰基輔酶A 羧化酶（ACCase）復合物的兩個基因簇，一個基因簇accA1編碼乙酰輔酶A 羧化酶復合物（ACC）的α亞基和β亞基，另一個基因簇pccB編碼丙酰輔酶A羧化酶（PCC）復合物的α亞基、β亞基、ε 亞基和生物素蛋白連接酶（Bpl）結構域。劉文團隊最早研究闡明了利用基因工程技術推測了參與利普司他汀合成的基因[47]，近期又報道了一個在利普司他汀生物合成中觀察到的例外情況，β-酮酰基載體蛋白合成酶Ⅲ（KAS-Ⅲ）的同系物LstA 和LstB，通過形成一種不尋常的異二聚體來催化C8和C14脂肪酰基CoA 底物的非脫羧Claisen縮合建立利普司他汀的C22脂肪族骨架[48]。

表1 國內外研究團隊研究概況

4 結語

近二十年來，全球超重和肥胖的發生率大幅增加，但在發現和開發高效、副作用小的新型抗肥胖藥物方面進展不夠。藥品監管機構因嚴重的不良反應已經撤銷了許多減肥藥（如Sibutramine,Rimonabant,Contrive,Phentermine）[10]。奧利司他在減肥藥市場中所占比例最大，全球市場2019 年銷售規模超30 億美元，未來五年將會達到60 億美元。毒三素鏈霉菌是生產利普他汀的主要菌株，目前科研工作者主要通過誘變育種、優化發酵參數、培養基組成和改變上下游加工因素，將利普司他汀產量提高到9667mg/L。如需進一步增加利普司他汀的產量對研究人員來說是相當具有挑戰性的。目前已對利普司他汀生物合成代謝途徑、分子機理進行了初步研究，絕大部分研究局限于高產菌株的誘變選育和培養基、培養條件的優化等方面，后續可從以下幾個方面展開研究。①代謝路徑優化，鏈霉菌次級代謝產物代謝途徑復雜、通路多，可選擇性敲除代謝支路，強化目標產物代謝途徑，使前體高通量流向目標產物。②基因工程定向改造，利用定向進化的基因工程方法對前體有效性和菌株發展進行研究，結合特異性位點突變和組合突變，通過單獨或組合優化關鍵酶的活性對合成機理進行研究。③數學模型高效調控，對利普司他汀發酵過程進行數學模型描述，精準控制工藝流程；改變鏈霉菌菌絲體細胞膜通透性，減輕胞內產物的反饋抑制，進一步提高生產水平及產品純度。

圖2 利普司他汀生物合成路徑

圖3 酰基輔酶A羧化酶（ACCase）復合物