高分辨質譜法快速篩查生鮮乳中的雌激素類藥物

貢松松，陸亞男，王 博，張 婧，吳劍平，嚴 鳳，曹 瑩

（上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103）

近年來，食品安全問題日益受到人們的關注。從蘇丹紅鴨蛋、三聚氰胺奶粉到瘦肉精“健美豬”事件，無一不牽動著全國百姓的神經。而重要原因就是濫用或非法使用獸藥或飼料添加劑，非法添加禁用物質。歐盟出臺了相關法規，嚴格規定獸藥殘留限量，我國在這方面，也出臺了相關規定。雌激素殘留已成為引起兒童性早熟及相關癌癥等多發的潛在危害[1-3]。

雌激素目前檢測方法主要有氣相色譜質譜聯用法[4]和高效液相質譜聯用法[5]。氣相色譜質譜法仍有缺陷，需要衍生化步驟，過程較為繁瑣。但高分辨質譜（本文以四級桿高分辨為例）通過既可以獲得精確分子量信息又能獲得二級及多級特征碎片離子信息，使其在多殘留分析領域優勢明顯[6,7]。本研究在傳統方法基礎上，改良QuEChERS[8-11]方法，建立一種快速篩查生鮮乳中7種雌激素的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲酸（色譜級）美國天地公司；乙腈（色譜級）美國默克公司；乙酸（分析級）上海凌峰化學試劑公司；無水硫酸鈉、氯化鈉（分析級）國藥集團化學試劑公司；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅烷（ODS C18）（美國安捷倫公司）；實驗用水為超純水。

己烷雌酚標準品（Hexestrol,HES）、雌酮標準品（Estrone,E1）、雌二醇標準品（Estradiol,E2）、炔雌醇標準品（Ethinylestradiol,EE2）、己烯雌酚標準品（Diethylstilbestrol,DES）、雌三醇標準品(Estriol,E3)、雙烯雌酚標準品（Dienestrol,DIE），純度均大于96.1%，購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。7種雌激素標準品見表1。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜—四級桿飛行時間質譜（6530，美國安捷倫公司）；MassHunter數據處理系統（美國安捷倫公司）；Allegra X-22R高速冷凍離心機（德國貝克曼公司）；多管漩渦振蕩器（北京踏錦公司）；Milli-Q超純水系統（美國密理博公司）；AE240電子天平（瑞士梅特勒公司）。

1.3 標準溶液的配制

標準品貯備液：分別稱取標準品各10 mg，置于7個10 ml的棕色容量瓶中，然后用甲醇溶液溶解并定容到10 ml，制備得到的單標貯備液濃度為1mg/ml。為制備標準曲線和質量控制樣品，使用時再根據需要混合或稀釋制成混合標準溶液。將所有的標準品貯備液置于4 ℃冰箱低溫避光保存。

1.4 樣品前處理

稱取5.0 g生鮮乳樣品，置于50 ml離心管中，加入20 ml 乙腈，渦旋振蕩1 min，稱取1.0 g氯化鈉和4.0 g無水硫酸鈉，渦旋震蕩4 min，9 000 r/min離心5 min。準確移取10 ml上層清液于離心管中，加入1.0 g無水硫酸鈉，0.2 g PSA，渦旋振蕩器振蕩 4 min，9 000 r/min離心5 min，取5 ml上層清液于40 ℃氮氣吹至近干，用1.0 ml乙腈-水溶液（5∶95，V/V）定容，渦旋30 s，過0.22 μm濾膜后，供超高效液相色譜—四級桿飛行時間質譜測定。

表1 7種雌激素類藥物的名稱、分子式、CAS號、保留時間、理論分子量、實測分子量、質量誤差以及質譜碎片離子信息

1.5 超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜條件

1.5.1 超高效液相色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）；流動相A為水，B為乙腈；梯度洗脫程序：0 min，5% B；2 min，5% B，2～4 min，5%～40% B；4～7 min，40%～80% B；7～7.5 min，80%～9 5% B；7.5～1 2 min，95%～95%B；12～13 min，95%～5%B；13～15 min，5%B；柱溫：35 ℃；流速：0.3 ml/min；進樣量：10 μl。

1.5.2 質譜條件 干燥氣流速：8 L/min；干燥氣溫度：320 ℃；陰離子模式；掃描范圍：50～1 000 m/z；霧化器壓力：35 psig；鞘氣流速：12 L/min；鞘氣溫度：400 ℃；毛細管電壓：3 000 V；噴嘴電壓：500 V；飛行時間管真空度：2.04×10-7；碎裂電壓：130 V；儀器在高分辨率（4 GHz），低質量范圍（＜m/z 1 700）下操作。7種雌激素類藥物的質譜分析參數和提取離子色譜圖分別見表1、圖1。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 色譜柱的選擇 為考察不同色譜柱的影響，本研究選取了SB C18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）、SB C18（3.0 mm × 100 mm，1.8 μm）和Extend C18（2.1 mm × 50 mm，1.8 μm）3種色譜柱。研究發現，第一種色譜柱SBC18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）分離效果最好，因為越小的內徑，峰形相對越對稱尖銳。柱長會影響保留時間，雖然5 cm比10 cm保留時間更短，但是有些藥物峰形較差。因此，如圖1所示，選用內徑更小的10 cm色譜柱，分離度更好，更有利于后續分析。

圖1 7種雌激素類藥物的提取離子色譜圖

2.1.2 流動相的優化 為考察不同藥物分離效果的影響因素，本研究選取水、0.1%甲酸水溶液、1%甲酸水溶液、0.1%乙酸水溶液、1%乙酸水溶液分別考察。實驗發現，當加入甲酸或者乙酸時，藥物峰形不對稱，分離度較差。當不加酸僅用超純水時，峰形較好。最終流動相選擇乙腈和水，結合梯度洗脫方式，7種藥物分離度較好。

2.1.3 梯度洗脫條件的優化 因為目標藥物的極性差異較大，采用梯度洗脫是最佳選擇。本研究通過改變有機相在初始流動相中的比例（5%、10%、20%）和不同洗脫時間（12 min、15 min、20 min）對洗脫效果進行研究。研究發現，當乙腈的初始比例為5%時種雌激素類藥物能緩慢洗脫下來，結合避免色譜柱上的藥物殘留和沖洗時間，最終選擇5%乙腈作為初始流動相，洗脫時間15 min。

2.1.4 定溶液的優化 實驗中發現，樣品進樣前的定溶液對目標藥物的分離效果和離子化效率具有很大影響。因此比較了超純水、乙腈一水（5∶95，V/V）、乙腈一水（20∶80，V/V）、乙腈一水（5 0 ∶5 0，V/V）和乙腈一水（90∶10，V/V）作為不同定溶液的影響，研究發現，當初始流動相中有機相的比例不小于定溶液時，峰形較好且對稱。當初始流動相中有機相的比例小于定溶液時，目標藥物峰形變寬，分離效果較差。因此，最終實驗選擇乙腈一水（5∶95，V/V）作為定溶液。

2.2 質譜條件的優化

陰離子模式下，通過一級質譜全掃描可以獲得目標藥物的總離子色譜圖。逐個選擇各個藥物的提取離子色譜圖，依據響應和峰形，依次對噴嘴電壓等相關參數進行優化。最后對碎裂電壓進行優化，得到最優的相關參數。最后參數見1.5.2。

表2 7種目標藥物的基質效應、線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限及定量限

2.3 樣品前處理方法的選擇

2.3.1 QuEChERS提取步驟的優化 所有的目標藥物為了都能提取到，提取溶液選擇了不同酸度的乙腈進行研究，具體為：乙腈、0.1%的甲酸乙腈、1%的甲酸乙腈、0.1%的乙酸乙腈、1%的乙酸乙腈。研究表明，最后4組的兩種藥物回收率太低，雙烯雌酚和己烷雌酚小于30%，且可能出現假陰性，己烯雌酚無法檢出，第一組藥物回收率總體滿意，所有藥物介于60%和120%之間，因此，最終選擇乙腈作為QuEChERS提取溶劑。

2.3.2 QuEChERS凈化步驟的優化 為了去除農殘，針對果蔬中脂肪酸色素等物質，傳統的QuEChERS方法選擇PSA作為吸附劑，但生鮮乳本身更加復雜，如不加去除，大量的脂肪和蛋白質會對實驗造成干擾。PSA和C18都可用于去除這些干擾成分，但是在凈化的同時，目標藥物有可能被吸附，所以要對二者進行必要的優化。如圖2所示，研究發現，分析所有藥物的回收率，C18組兩種藥物低于50%，與之相比，選擇PSA用于凈化，所有藥物回收率介于60%～120%之間，故最終選擇PSA用于QuEChERS凈化。

圖2 優化實驗條件的回收率實驗

2.4 方法學驗證

表3 7種目標藥物的加標回收率及相對標準偏差（n=6）

2.4.1 標準曲線與線性范圍 由于生鮮乳基質的復雜性，因此要對基質效應進行考察。分別選擇空白生鮮乳樣品基質溶液和初始流動相配制標準溶液，制作標準曲線。基質效應ME=k1/k2×100%計算。其中k1、k2分別是兩套標準曲線的斜率。實驗發現，雌三醇基質增強效應明顯，3種藥物基質抑制效應明顯。本研究最終使用基質匹配標準曲線外標法用于定量。

2.4.2 檢出限（LOD）與定量限（LOQ）對標準曲線的最低濃度用空白樣品基質提取液逐級稀釋，各藥物的定性檢出限，以3倍信噪比（S/N=3）計算，以10倍儀器檢測信噪比（S/N=10）計算定量限，實驗發現，目標藥物LOD為5～20 μg/kg，LOQ為10～50 μg/kg。相關數據見表2。

2.4.3 回收率與精密度 將低、中、高3個濃度的標準溶液分別添加在空白生鮮乳樣品中，平行測定6次，統計相對標準偏差及計算平均回收率。結果表明，目標藥物的回收率為 63.5%～ 115.6%，相對標準偏差為3.4%～11.4%。相關數據見表3。

2.5 實際樣品的篩查

利用已建立的方法初次對來自全國的80份生鮮乳樣品進行篩查，對可疑數據結合二級特征碎片離子比對，檢出了不同含量的雌三醇、雌酮。

進一步分析發現，作為天然激素，雌三醇、雌酮本身就是奶牛體內的內源性激素。

3 結論

本研究建立了一種高分辨質譜快速篩查與確證生鮮乳中雌激素類藥物的方法。改進了前后處理方法，快速簡便，準確性高，可作為該類藥物的篩查方法。