基于線粒體Cytb基因探討大尾羊與國內外綿羊品種的系統發生關系

陳天瑩，胡 峻，李孟純，喬自林，李 鈾，2*

（1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730100；2.西北民族大學 生物醫學研究中心/甘肅省動物細胞技術創新中心，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 生物醫學研究中心 生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030）

綿羊是世界上最早馴化的一批畜種。我國綿羊品種種類繁多。世界上不同生產方向的綿羊品種和類型有700多個，其中大部分是用來生產毛與肉[1]。就綿羊的分布而言，其在世界各地均有分布，并且不同國家地區通過雜交育種等方式培養了一系列新型品種，比如，法國國立農業科學研究院曾致力于培育新的基因型品種羅曼諾夫羊×白里松羊，新培育的基因型品種與純血統的母本品種相比，每只母羊產羔數增加了65%[2]。法國還利用“拉康”羊與東弗里生羊和沙爾金羊進行多品種雜交，所培育的新品種繼承了東弗里生產奶量高，沙爾金羊易擠奶、對當地條件適應性強的優點[2]。早在20世紀70年代，西德北威斯特伐利亞就引進了蘭頭門羊并與代克塞、東弗里生和德國黑頭羊等品種進行雜交，培育出的新品種具有產羔率高，早熟，肉品質好的特點[2]。

我國綿羊品種種類繁多，結合各地區的氣溫以及地形等因素，可將我國綿羊分布劃分為多個區域，由沿海區的寒羊、湖羊，到云貴高原區的小尾寒羊，再到北疆區的哈薩克羊、當巴什羊[3]。地域的差異造就了綿羊品種的不同，并且通過雜交培育出了藏系綿羊，它適應高寒牧區惡劣的自然環境，耐粗放的飼養管理條件，具有產肉性能良好、毛纖維長、光澤良好等優點。

但由于長期進行雜交，新的經濟價值高的品種不斷形成導致世界各國生產性能低的古老地方品種和培育品種，趨于減少，瀕于消失甚至泯滅，并引發世界性的畜禽品種資源危機[4]，綿羊資源的保護迫在眉睫。目前已出現利用地方品種來改造培育品種達到對該物種保護的目的，如在澳大利亞，有學者提出，由非洲國家引入無毛羊給澳洲美利奴羊導入一次血液，在保留澳洲美利奴羊現有價值的特性不變情況下，提高其耐苦性和適應性，使澳洲美利奴羊在干旱地區得到發展[5]。我國的洼地綿羊則采取了建立洼地綿羊純種保護區，育種核心群、凍精凍胚保種基因庫、純種繁育體系等方式[6]，對該物種進行有效的保護。

在我國甘肅省分布有藏羊、大尾羊與小尾羊等品種。其中蘭州大尾羊（Lanzhou fat tailed sheep）是我國特有的綿羊地方品種，但同時也是一個瀕臨滅絕的畜種，研究結果表明，其滅絕頻率為0.77，為北方11個綿羊品種之首，品種貢獻率為10.52%，居于第三，保護潛力為0.141 9，居第1位。因此，保護蘭州大尾羊這一珍貴的地方綿羊品種迫在眉睫[7]。

線粒體DNA（mtDNA）是動物體內唯一長期、穩定存在的核外基因組，其在世代間沒有基因重組，呈現嚴格母系遺傳，mtDNA在細胞內以多拷貝形式存在，平均可達數百個拷貝，肝臟細胞可達數千個拷貝。因此，動物線粒體基因影響廣泛，同時具有高突變率等特點，其突變速率為單拷貝核DNA的5～10倍，被廣泛用于動物起源進化、物種鑒定、疾病診斷、衰老及動物經濟性狀的核外基因效應研究[8]。目前我國的蘇蕊、楊鐘[9]等已有對內蒙古絨山羊線粒體基因組序列測定以用來的起源、進化、不同類群的分化以及特定遺傳特性形成機制。陳曉勇等則對小尾寒羊線粒體基因組遺傳變異分析進行了探索與研究并為mtDNA多態性與經濟性狀關聯分析及核外遺傳效應研究提供分子生物學基礎[8]。故可通過對這一類DNA變異的研究來探討群體間的親緣關系。而一般觀點認為家綿羊可能的祖先是亞洲和歐洲的摩弗倫羊（Ovismusimon）羱羊（Capraibex）阿卡爾羊（Ovisorientalis）等幾個野生綿羊種[10]。張麗娟[11]等的研究認為綿羊最初的馴化地只可能在亞洲，并且中國綿羊至少具有兩種不同的母系起源。

本研究對甘肅地區的大尾羊綿羊品種的線粒體Cytb基因（Cytochrome b gene）進行擴增，將得到的擴增序列與在GenBank上下載的國內外其他綿羊品種的Cytb基因的擴增序列進行進化樹分析，探討種群之間的系統發生關系，對研究甘肅地區的綿羊品種起源以及對綿羊品種的保護和利用有著一定的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

甘肅永靖某羊場采集大尾羊耳緣肌肉組織樣本（n=6，DL1-DL6）。樣本置于1∶1配比的100%乙醇與生理鹽水組織保存液中待后續使用。

1.2 基因組擴增

使用Gentra Puregene extraction kit（Gentra Systems Inc.）從動物組織中提取高純度、高分子量的基因組DNA。并參照已發表的綿羊cytb基因序列設計引物，由寶生物工程（大連）公司合成。引物序列、退火溫度及產物大小見表1。

取上、下游引物各0.5 ul，濃度為（10 mM）；DNA樣品（50 ng/ul）2 ul，并添加PremixTaq（Takara）的量為12.5 ul，濃度為5U/ul；最后補加9.5 ul的無菌水，得到最終的25 ul的反應體系。

表1 引物信息

將制備的反應體系置于PCR儀器中進行擴增，PCR反應條件為：94℃預變性3 min；94℃變性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環35次；最后72℃延伸10 min，最后將擴增產物進行1.4%瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像儀上檢測。

1.3 數據處理及進化樹的建立

將大尾羊的PCR擴增產物送至天啟基因生物科技有限公司（甘肅蘭州）進行測序，使用Geneious11.0.4處理測序所得原始AB1文件，人工校對后得到樣品序列，并從GenBank上下載國內外綿羊品種的cytb基因序列見表2（n=22），使用Geneious11.0.4比對并處理序列。

使用MEGA-X建立進化樹前先進行遺傳距離算法模型分析，在MODEL中使用Find Best DNA/Protein Models（ML）來選擇在建立ML樹時應選擇的遺傳距離算法模型。

建立進化樹時，選擇盤羊Ovisammon作為外群。使用MEGA-X中的最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構建ML樹；鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建NJ樹。ML樹參數為1 000次Bootstrap重復，模型分析中所得最佳的方法計算遺傳距離；NJ樹參數為1 000次Bootstrap重復，p-distance法計算遺傳距離。

表2 從GenBank上下載的國內外綿羊品種的cytb基因序列

圖1 遺傳距離算法模型計算結果

2 結果

將實驗所得結果交由公司測序，各個樣品最終序列大小均在900～1 020 bp之間，經Geneious11.0.4人工校對并與國內外cytb基因序列比對處理后大小為964 bp。

在遺傳距離算法模型分析中，具有最低BIC分數（貝葉斯信息標準）的模型被認為是描述替換模式的最佳模型。對于每個模型，還給出了AICC值（Akaike信息準則，修正）最大似然值（LNL）和參數數量（包括分支長度）。

為了估計ML值，自動計算了樹形拓撲。這項分析涉及31個核苷酸序列，數據集中共有964個職位，最終由所得圖1中可以得出，最低BIC分數的模型為HKY模型。

利用ML法及NJ法，經過Bootstrap自舉檢驗1 000次可得如圖2、圖3兩個進化樹，其中盤羊是選取的外群，這兩種建樹方法能夠較好地區分外群，并且兩種建樹方法所得ML樹與NJ樹的結構基本相似。

圖2 基于線粒體Cytb基因構建的NJ樹

如圖2所示，從構建的NJ樹中可以看出樣本DL4、DL5距離近，與烏拉藏羊、烏拉黑羊、吐魯番黑羊、葉城羊、察庫爾干羊等10個品種聚為一支，它們的親緣關系較為密切；樣本DL1、DL2距離近，與薩赫勒羊、賈倫克羊、普拉門卡羊、庫伊布斯科夫羊、烏德穆爾提安羊等10個品種親緣關系較為密切，聚為一支；樣品DL3和DL6在同一分支，但兩者之間仍具有一定的親緣距離，并且相較于樣本DL1、DL2、DL4、DL5及其他近緣種羊的親緣關系較遠；盤羊屬于外群，與前幾者的親緣關系較遠。

圖3 基于線粒體Cytb基因構建的ML樹

如圖3所示，從構建的ML樹中可以看出樣本DL1、DL2距離近，與圖申羊、卡拉迪羊、奧帕里諾羊、漢中羊、賈倫克羊等10個品種聚為一支，其親緣關系較為密切；可以看出樣本DL4、DL5距離近，與烏拉黑羊、烏拉藏羊、哈姆達尼羊、巴什貝羊、巴音布魯克羊等10個品種親緣關系較為密切，聚為一支，且樣本DL1、DL2、DL4、DL5之間親緣關系較近并與其他近緣種羊有著較為密切的關系；樣品DL3和DL6在同一分支，但兩者之間仍具有一定的親緣距離，且與其他樣本的親緣關系較遠；盤羊仍是明顯的外群，與前幾者的親緣關系較遠。

3 討論

根據本文構建的進化樹可以分析得出，樣本DL1、DL2與同支上的10種羊親緣關系密切，可能是因為這兩個樣本羊與這12種羊存在基因流；DL4、DL5與同支的10種羊親緣接近也可能是類似的原因。同時，本研究中使用的樣本與文獻中已發表的大尾羊樣本（序列號KF938335.1）并未聚在一支，表明現存大尾羊可能存在較為嚴重的雜交情況，為大尾羊的純種保護提出了挑戰。

值得注意的是，樣品DL3和DL6在130bp、251bp、316bp、319bp、399bp、736bp、862bp這幾個位點出現了單核苷酸變異，導致其與其他大尾羊樣本遺傳差異較大。除此以外樣本DL3在619bp、658bp這兩處位點也出現了單核苷酸變異而樣品DL6則沒有，且兩者在736bp、399bp、316bp、251bp的單核苷酸變異程度并不一致，從而導致這兩個樣本之間產生差距。樣品DL3和DL6于cytb基因上發現的單核苷酸變異，在本研究使用的其他樣本中并未出現。這些變異出現的原因，以及其是否與本土其他綿羊品種存在雜交情況，仍需進一步研究。

本研究對甘肅地區的大尾羊綿羊品種的線粒體基因cytb進行擴增測序并對其基因組成進行分析，初步構建了與其他國內外羊的系統進化樹，研究就基于cytb線粒體基因將甘肅地區的主要地方綿羊品種蘭州大尾羊與國內外部分綿羊品種進行了比較，來探討種群之間的系統發生關系，這對蘭州大尾羊品種起源提供了理論依據，并對研究甘肅地區的綿羊品種起源以及綿羊品種的保護和利用有著一定的意義。