肉牛肝臟miR-23a的靶基因及生物學功能預測

（黑龍江八一農墾大學，黑龍江 大慶 163319）

運輸對畜牧業是一種常見的應激源，當動物處于一系列負面刺激，如振動、噪聲、環境的變化等因素，都可能導致應激的發生，進而影響動物的生產性能[1]。運輸引起的應激已經成為危害肉牛生產性能的重要元素之一。在應激發生的過程中，機體的多種生物系統會響應應激反應。研究表明，miRNAs與多種應激反應密切相關[2]。在應激發生時，機體內多種系統會作出反應，來抵抗應激帶來的不良影響，其中，miRNAs便是參與者之一，其通過調控靶基因翻譯過程，影響一系列蛋白表達，從而抵抗應激反應。了解miRNAs與應激之間的聯系，對闡明運輸應激發生發展機制有著深遠意義。miR-23a的表達失調會導致多種疾病，某些miRNA基因已被分類為癌基因或抑癌基因。此外，在應激細胞中抑制miR-23a能夠闡釋誘導細胞凋亡的一般機制，并被分子伴侶HSP70調控。miR-23a參與多種癌癥的發生發展過程。有文獻報道，miR-23a在結腸癌、胃癌和肺癌等腺癌中具有高表達的特性[3,4],具有調控細胞的正常生長和分化，和多種惡性腫瘤的生長和轉移等生物學行為具有密切相關性。miR-23a在應激發生中可能發揮的生物學功能，是本研究的目的所在。

1 試驗方法

1.1 材料與方法

試驗動物及分組試驗與牛場隨機選取10頭體重相近的健康雜交肉牛分為對照組和運輸刺激組，運輸刺激組以單層動物運輸汽車運輸進行運輸刺激，速度為80 km/h。運輸過程中禁食、禁水。

1.2 高通量測序

采集肝臟組織深圳基因組學研究所的程序（BGI BGISEQ-500，中國）進行高通量測序，制備運輸應激肉牛肝臟miRNA文庫。

1.3 對miR-23a進行生物信息學分析

應用Targetscan、miRWalk和miRTarBase三款軟件對miR-23a的靶基因進行預測分析，對miR-23a可能發揮的潛在功能進行預測，以便了解miR-23a的生物學功能。

1.4 miR-23a候選靶基因功能富集分析

利用Gene ontology(http://geneontology.org/)對miR-23a參與的生物學進程進行Geneontology分析，進行靶基因的功能研究，以牛（bos taurus）基因組作為背景基因，對miR-23a靶基因參與的生物學過程進行富集分析。從而篩選出與運輸應激相關性強的靶基因。

2 結果

2.1 肝臟組織中miR-23a表達量的變化

使用高通量測序方法檢測肉牛肝臟中miR-23a的相對表達量。與運輸0 h組相比，運輸6 h組肝臟組織中miR-23a表達量上升（見表1）。

表1 肉牛肝臟miR-23a表達量

2.2 Go富集分析結果

應用Targetscan、miRWalk和miRTarBase三款軟件對miR-23a靶基因預測，Targetscan中預測到1 238種靶基因；miRWalk中預測到10 112種靶基因；miRTarBase中預測到427種靶基因。三款軟件預測到的靶基因重合情況如圖1和表2所示。

圖1 miR-23a靶基因預測統計圖

2.3 生物信息學分析結果

2.3.1 生物進程 通過GO分析(http://amigo.geneontology.org/amigo/search/anno-tation) 繪制出miR-23a靶基因參與的生物進程。如圖2所示，miR-23a主要參與14種生物過程，其中富集靶基因較多的前三項過程為細胞過程，代謝過程，生物調節富集靶基因這些過程均與應激存在聯系，其中對刺激的反應這一過程與應激聯系密切。

圖2 miR-23a參與的生物學進程圖

2.3.2 分子功能 通過GO分子功能分析，miR-23a主要參與7種“分子功能”過程（見圖3），包括斑點、催化活性、分子功能調節劑、結構分子活性、轉錄調節因子活性、轉運蛋白活性。

表2 miR-23a的靶基因統計

圖3 miR-23a參與的分子功能

2.3.3 細胞組分 miR-23a主要參與11種“細胞組分”過程（見圖4），包括細胞組分、細胞、細胞外區部分、含蛋白復合物、超分子復合物。

圖4 miR-23a參與的細胞組分圖

3 討論

在集約化養殖發展的過程中，運輸成為一項常見且危害極大的應激原，運輸可造成肉牛運輸應激綜合征等多種疾病進而影響肉牛的健康，同時也會造成巨大的經濟損失。研究表明，運輸會造成肉牛發生應激反應，影響免疫力，同時造成細胞因子和應激相關激素的變化，同時造成miRNSs表達失調，影響相關蛋白的表達。檢測肉牛肝臟中miRNAs的表達變化，可以作為評估肉牛應激狀態的新手段。本試驗通過高通量測序技術篩選出肉牛運輸后差異表的miR-23a，并對其進行生物信息學分析。通過對靶基因的生物信息學分析發現，miR-23a可能與HSPA13、MAP3K5、AKT3、IL6R等基因結合，從而調控其靶向蛋白的表達。研究表明，miR-23a-5p對大鼠腦缺血再灌注氧化應激反應具有抑制作用[5]，沉默miR-23a并過表達gls1，可以逆轉H2O2誘導的氧化應激，對細胞氧化損傷的抑制作用[6]。miR-23a參與多種疾病的發展過程，并可以調控細胞周期[7]。研究顯示，肝細胞癌組織中miR-23a-3p的表達水平明顯上調，并可以促進肝細胞癌G1/S細胞周期轉化[8]，HSPA13家族與應激關系密切，研究表明，HSPA13的下調會提升細胞凋亡的敏感性，促進炎癥反應并維持細胞存活[9]。當運輸刺激發生時,miR-23a表達量的降低，有可能會促進Akt基因的表達，Akt蛋白激酶在細胞凋亡、細胞增殖、細胞分化、生理代謝等細胞生理病理活動的調控中起著至關重要的作用，因此，miR-23a、HSPA13、Akt三者密切相關。李夢雯等人研究結果顯示氧化應激可誘導細胞中HSPA13表達上調，通過KEGG分析發現，HSPA13與PI3K-Akt信號通路、TGFβ信號通路相關，這與研究相符，同時HSPA13可以保護細胞，減輕氧化損傷。當動物處在應激狀態時，miR-23a表達發生改變，且調控HSPA13、Akt等蛋白表達來抵抗應激的發生，減輕或避免疾病發生，因此在畜牧疾病防控中發揮關鍵作用。本文通過對運輸應激肉牛肝臟miR-23a進行生物功能分析，能夠為肉牛應激的發生發展提供理論參考。