甘肅省興隆山區域叢枝菌根真菌多樣性初探

董萬清，閆智臣，鄧 杰，李應德，丁婷婷，段廷玉

（蘭州大學草地農業生態系統國家重點實驗室 / 蘭州大學農業農村部草牧業創新重點實驗室 /蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州 730020）

菌根是植物根系在漫長進化過程中與土壤真菌構建的互惠共生體，作為生態保護和農牧業發展的重要參與者，其在經濟、社會和生態方面均發揮著不可替代的作用[1]。菌根真菌作為菌根共生體的關鍵性要素，受到學者的廣泛關注，尤其是叢枝菌根(arbuscular mycorrhizal, AM)真菌，可與80%的陸地植物構建共生關系[2]，且對生存環境要求較低，在森林、草原、沙漠、農田、河漫灘、鹽堿地、工業污染區等各種環境條件下均能存活[3-9]，不僅能促進植物生長[10-11]、優化根系養分吸收[12-13]、改善土壤結構[14]、增強植物抗逆性(抗病性、抗旱性、耐鹽性、耐金屬性等)[15-18]，還可參與調控所處生態系統的穩定性和生產力[19-20]，在生態系統中承擔著極其重要的角色。因此，AM 真菌資源調查日益受到國際社會的重視[21]。

我國是世界上物種多樣性最高的國家之一，截止2018 年，國內已發現AM 真菌虛擬種145 個，涵蓋8 科12 屬，約占全球已知AM 真菌的42%，這表明我國貯藏著豐富的AM 真菌資源，具有巨大的開發潛力和應用價值[22]。近年來，諸多學者在全國范圍內展開AM 真菌資源分布、物種多樣性、群落特征、發生規律等相關調查研究[6,9]，以便全面了解和掌握各地區AM 真菌資源現狀。然而，我國國土面積遼闊，氣候類型復雜，植被多樣性高，極易受小氣候影響而形成特殊生態系統，所以尚有諸多地區未進行AM 真菌資源調查，且AM 真菌多樣性在不同氣候、生境下的分布差異較大，因此，要全面掌握我國AM 真菌多樣性的整體情況，仍需要進行大量的調查研究[22]。

甘肅省興隆山國家級自然保護區地處東亞內陸，因其地理位置的獨特性，被稱為隔離的“林島”[23]。作為森林生態系統，保護區內植物資源豐富，現存高等植物1 022 種，常形成喬灌草混合林帶，被稱為甘肅境內植物資源“基因庫”[23]。而植物多樣性往往與AM 真菌多樣性密切相關，兩者間存在著積極的作用[2,24]。因此，保護區內可能蘊藏著豐富的AM 真菌資源，且其在維持和保護當地生態系統的穩定和發展方面可能發揮著重要作用，但目前尚缺乏該方面的基礎資料，所以有必要開展相關AM 真菌多樣性調查工作。

基于此，本研究以興隆山自然保護區為研究地，在不同海拔高度開展AM 真菌資源分布及多樣性調查工作，以期為興隆山AM 真菌資源應用提供數據資料，并豐富已知AM 真菌種質資源庫，為后續研究工作的開展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

甘肅省興隆山國家級自然保護區是蘭州市榆中縣(103°50′ ? 104°10′ E, 35°38′ ? 35°58′ N)重要的生態屏障，受地形和海拔的影響，保護區內氣候差異較大，年平均氣溫3～7 ℃，年均降水量為340～520 mm[25-26]。植被種類豐富，主要有青杄(Picea wilsonii)、小檗(Berberis thunbergii)、珍珠梅(Sorbaria sorbifolia)、白蓮蒿(Artemisia sacrorum)等。興隆山是保護區內三大山脈(興隆山、馬銜山和棲云山)之一，分為東、西兩峰，海拔約2 500 m。

1.2 樣品采集

本研究以植被豐富的興隆山東山(喬灌草混合林帶)為研究樣地，選取2 000～2 600 m 海拔區域，于2019 年8 月按縱軸方向自下而上采集土壤樣品共計40 份。樣地以海拔高度為基準，選取了8 個海拔梯度，各海拔間間隔約50 m，從低到高依次為2 168、2 209、2 261、2 313、2 361、2 408、2 466 和2 601 m。不同海拔梯度內設置5 個樣點，各樣點按等邊三角形三點取樣，采集0 - 10 cm 表層土壤，過2 mm 土壤篩后，將3 個分樣品混合均勻，取一定量土壤于2 mm 離心管內，準確編號后帶回實驗室，置于?80 ℃冰箱保存，后送至北京百邁客生物科技有限公司測序。

1.3 AM 真菌多樣性測序

1.3.1 土壤DNA 提取及PCR 擴增

采用MN NucleoSpin 96 Soi 試劑盒法提取土壤樣品基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取效果，并進行PCR 擴增。第一次PCR：取適量DNA 樣品，用無菌水稀釋至1 ng·μL?1，以其為DNA模板，根據選定的測序區域，使用特異性引物AMV4.5NF-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG、AMDGRCCCAACTATCCCTATTAATCAT 進行擴增，反應條件為95 ℃預熱5 min；25 個循環：95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s；72 ℃延伸10 min。

第二次PCR：對上述目標區域PCR 純化產物進行稀釋，并以其為模板進行PCR，98 ℃預熱30 s；10個循環：98 ℃變性10 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸5 min。擴增完成后，對其產物進行1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。根據PCR 產物濃度進行1 : 1 等量混樣，并利用OMEGA DNA 純化柱純化，于1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，后進行切膠回收。

1.3.2 上機測序及數據處理

AM 真 菌 多 樣 性 檢 測 選 擇 Illumina HiSeq 測 序平臺，測序結束后選用FLASH[27](version 1.2.11)和Trimmomatic[28](version 0.33)軟件對原始數據進行雙端拼接及質量過濾，獲得高質量Tags 序列，之后通過UCHIME[29](version 8.1)軟件完成嵌合體清除過程，獲得有效數據。

1.3.3 物種注釋和分類學分析

采用Usearch 軟件[30]在97%的相似度水平下對優化序列進行聚類，以測序所有序列數的0.005%為閾值過濾OTU，并結合NCBI 和MaarjAM 數據庫信息，對其代表序列進行物種注釋，以確定不同分類水平下(門Phylum, 綱Class, 目Order, 科Family, 屬Genus,種Species)各樣品中AM 真菌的群落構成及其系統發育關系。

1.4 統計分析

使用R 3.6.1 軟件[31]計算樣品物種水平Alpha 多樣性指數；利用Excel[32]柱狀堆積圖和餅狀圖分別表示AM 真菌相對豐度和物種組成；采用SPSS 22.0[33]單因素方差分析和多重比較的檢驗方法比較不同海拔間AM 真菌多樣性指數的差異，Spearman 相關性分析描述AM 真菌多樣性指數與海拔因子的相關性；運用MEGA 7[31]繪制不同AM 真菌系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 AM 真菌種屬分類

在一定范圍內，隨著測序條數的加大，稀釋曲線總體上趨于平緩(圖1)，說明本研究測序數據量足以反映當地土壤中AM 真菌的基本情況，可以進行后續數據分析。

圖1 樣品稀釋曲線Figure 1 Sample rarefaction curves

本研究分離獲得AM 真菌共52 種，隸屬于4 目8 科13 屬(表1)，具體為原囊霉目(Archaeosporales)2 科2 屬，多樣孢囊霉目(Diversisporales) 3 科4 屬，球 囊 霉 目(Glomerales) 2 科6 屬， 類 球 囊 霉 目(Paraglomerales) 1 科1 屬。通過對測序OTU 代表序列進行數據庫比對，采用鄰接法(Neighbor-joining)進行系統進化分析(圖2、圖3)，鑒定為球囊霉屬(Glomus) 20 種，原 囊 霉 屬 (Archaeospora) 9 種，類球 囊 霉 屬 (Paraglomus) 6 種， 近 明 球 囊 霉 屬(Claroideoglomus) 5 種，多樣孢囊霉屬 (Diversispora)3 種，硬 囊 霉 屬 (Sclerocystis) 2 種，雙 型 囊 霉 屬(Ambispora)、無梗囊霉屬 (Acaulospora)、盾巨孢囊霉屬 (Scutellospora)、巨孢囊霉屬 (Gigaspora)、多氏囊霉屬 (Dominikia)、根孢囊霉屬 (Rhizophagus)和斗管囊霉屬 (Funneliformis)各1 種。但部分菌種系統進化發育并不完全符合規律，如球囊霉屬的Glomus sp.2、Glomus sp.6、Glomus sp.8、Glomus sp.10、Glomus sp.11 和Glomus sp.12，其在進化樹中與其他同屬菌種并未聚在同一分支(圖3)。

表1 Arbuscular mycorrhizal (AM)真菌種屬分類Table 1 Classification of arbuscular mycorrhizal fungal species

續表1Table 1 (Continued)

圖2 屬水平上arbuscular mycorrhizal 真菌的物種數目Figure 2 The number of arbuscular mycorrhizal fungal species at the genus level

2.2 AM 真菌豐度及海拔分布特征

2.2.1 不同海拔梯度AM 真菌資源分布

興隆山東山地區AM 真菌資源分布總體上表現為：優勢種屬和特有種屬隨海拔變化呈現規律性分布，其余各屬種則均勻分布于不同海拔梯度。屬水平上，從低海拔到高海拔，AM 真菌優勢屬由球囊霉屬逐漸轉變為類球囊霉屬(除2 168 m 海拔梯度)，其中球囊霉屬在2 209～2 313 m海拔范圍內為優勢屬，分別占各海拔的73.87%、81.23%和47.10%，類球囊霉屬為2 361～2 601 m 海拔優勢屬，占各海拔的72.50%～89.41%；無梗囊霉屬和巨孢囊霉屬為部分海拔特有屬(圖4)。

不同海拔梯度AM 真菌種水平上組成存在差異(表2)。類球囊霉屬sp.2、球囊霉屬sp.8 和近明球囊霉屬sp.1 為該地區不同海拔優勢種，其類球囊霉屬sp.2 為各海拔共有優勢種(除2 261 m 海拔外)，球囊霉屬sp.8 在2 209～2 313 m 和2 466 m 海拔內為優勢種，近明球囊霉屬sp.1 為2 313 m 海拔優勢種。蜜色無梗囊霉、球狀巨孢囊霉、白色球囊霉、球囊霉屬sp.1、球囊霉屬sp.4 和彎絲硬囊霉僅在部分海拔梯度出現，分別為不同海拔特有種。

2.2.2 不同海拔AM 真菌多樣性

不同海拔AM 真菌多樣性指數(表3)顯示，測序文庫覆蓋度均在0.999 9 以上，測序結果準確可靠。在97%相似性水平下，沿低海拔至高海拔梯度，Chao1 和ACE 指數總體上呈現出先增后減的變化趨勢(除2 168 m 海拔外)，且在2 361 m 海拔梯度達到峰值。其中，在2 361 m 時，Chao1 指數極顯著高于2 209、2 408 和2 466 m (P ＜ 0.01)，ACE 指數顯著高于2 408 m (P ＜ 0.05)。Simpson 指數和Shannon指數在不同海拔間差異均不顯著，表明各海拔梯度物種多樣性組成相似。

2.3 AM 真菌分布與海拔高度相關性

圖3 Arbuscular mycorrhizal 真菌系統進化樹Figure 3 A phylogenetic tree of arbuscular mycorrhizal fungi

圖4 Arbuscular mycorrhizal 真菌屬水平相對豐度Figure 4 The relative abundance of arbuscular mycorrhizal fungi at the genus level

利用AM 真菌豐富度和多樣性指數(Chao1、ACE、Shannon 和Simpson 指數)與海拔高度進行Spearman相關性分析，結果表明各指數與海拔間相關系數依次為?0.291, ?0.277, 0.026 和?0.041，均未達到顯著水平(P ＞ 0.05)，說明該地區AM 真菌資源分布受海拔因子的影響較小，兩者間不具有直接的相關性。

3 討論

興隆山自然保護區作為甘肅蘭州榆中縣的“綠色巖島”，因其獨特的地理位置，對當地生態穩定、物質循環、能量流動等方面具有重要意義，保護區基于氣候、海拔、土壤等多種環境因子綜合調控，孕育了豐富的生物資源[34-35]。本研究首次對興隆山東山AM 真菌資源多樣性進行調查研究，并分析了海拔高度對其種屬分布的影響，研究結果是對我國AM 真菌資源分布情況的有益補充。

利用AM 真菌最新分類系統對高通量測序結果進行種屬鑒定，發現研究區內AM 真菌可分為4 目8 科13 屬52 種，約占我國已知AM 真菌總數的三分之一，說明興隆山東山AM 真菌資源較豐富。因此，后續工作應擴大調查范圍，對興隆山自然保護區其余地區深入開展資源調查工作，以全面了解和掌握該地區的AM 真菌資源狀況，豐富我國已知AM 真菌種質資源數據庫。

不同AM 真菌對環境因子的適應性不同，常因環境條件的差異而呈現不均衡分布[36]。本研究表明，興隆山東山不同海拔梯度下AM 真菌優勢種屬隨海拔變化呈現規律性變化，其中球囊霉屬在2 209～2 313 m 海拔為優勢屬。尚昆等[37]對梵凈山不同海拔AM 真菌多樣性的研究表明，球囊霉屬在梵凈山地區主要分布于1 800 m 海拔以下地區，在2 100～2 200 m 海拔范圍內未見其分布，而蔡曉布和彭岳林[38]研究發現，球囊霉屬可在西藏高原2 200～5 300 m 海拔地區廣泛分布，說明AM 真菌在水平和垂直方向的種屬分布可能受海拔及由此引致的溫度等因素的調控，且球囊霉屬具有較為廣泛的生態適應性，可分別在低、中、高海拔地區生存。

諸多研究表明，同一研究區內，不同海拔梯度下AM 真菌豐富度及物種多樣性存在顯著差異[38-39]。本研究中AM 真菌豐富度指數在部分海拔間存在顯著差異，且隨海拔變化呈現出“單峰”分布，但物種多樣性指數在不同海拔梯度間差異較小，未表現出顯著差異。Gai 等[40]對西藏高原地區AM 真菌多樣性研究發現，隨海拔高度的增加，AM 真菌物種多樣性指數無明顯變化，這與本研究結果保持一致，但尚昆等[37]和Wu 等[41]對梵凈山和富士山AM 真菌群落相關研究中發現，AM 真菌多樣性隨海拔的增加分別呈現出增加和減少的趨勢。由此可見，不同地區AM 真菌多樣性分布隨海拔變化的分布狀況不盡一致。與此類似，研究區不同，海拔高度對AM 真菌豐富度指數的影響也不同。李曉亮[42]對藏東南地區海拔對AM 真菌多樣性及群落結構影響的研究發現，海拔可直接影響AM 真菌OTU 豐富度，而李龍等[43]在高黎貢山的研究中表示，隨海拔的升高，AM 真菌豐富度指數逐漸降低，但其原因主要是不同海拔間植物豐富度和土壤理化性質不同而引起的變化，即海拔間接影響該地區AM 真菌物種豐富度。

表2 不同海拔arbuscular mycorrhizal 真菌物種組成Table 2 The composition of arbuscular mycorrhizal fungal species at different altitudes

續表2Table 2 (Continued)

根據不同海拔間AM 真菌多樣性分布結果分析可知，AM 真菌物種豐富度及多樣性受海拔因子的調控。本研究中，研究區內AM 真菌資源分布特征在一定程度上受海拔變化的影響，但相關性不顯著。經分析，原因可能有以下兩個方面：一是研究區內海拔跨度較小，不同海拔間環境條件基本一致，不足以引起AM 真菌群落的顯著性差異。蔡曉布和彭岳林[35]對西藏高原AM 真菌群落相似度分析結果表明，同一海拔區內，不同海拔梯度間差異越小，其AM 真菌群落特征相似性越高；Pérez 和Frangi[44]也發現，在草原生態系統中，絕對海拔低且海拔間跨度較小時，海拔對AM 真菌群落無影響。二是影響AM 真菌種屬組成及多樣性分布的環境因素較多，如植物種類、土壤有機質、pH、溫度、降水量等，推測海拔高度可能不是直接影響興隆山東山AM 真菌資源分布的主導因子，但具體情況有待進一步研究。

表3 不同海拔arbuscular mycorrhizal 真菌多樣性指數Table 3 Diversity indices for arbuscular mycorrhizal fungi at different altitudes

此外，本研究中AM 真菌資源在2 168 m 海拔梯度的分布狀況并不遵循其他海拔的變化規律，分析原因可能是該海拔位于東山旅游區入口附近，受人類活動干擾較大，致使其AM 真菌群落隨海拔等環境因子的規律性分布遭到了破壞，應加以保護。

4 結論

甘肅省興隆山東山AM 真菌資源豐富，約52 種，隸屬于4 目8 科13 屬，其中Glomus 和Paraglomus 為優勢屬，Glomus albidum、Acaulospora mellea、Gigaspora margarita、 Glomus sp.1、 Glomus sp.4、 Sclerocystis sinuosa 為部分海拔特有種，上述優勢物種及特有物種分布表現出了一定的海拔特異性。