UHPLC法測定參附注射液中單酯型生物堿含量

袁海英,蔡幫軍

(華潤三九（雅安）藥業有限公司，四川 雅安 625000)

0 引 言

參附注射液是由紅參和附子制成的中藥復方制劑，源自著名驗方參附湯，主要有效成分為人參皂苷、人參三醇類物質和烏頭類生物堿[1]。參附注射液臨床主要用于陽氣暴脫的厥脫癥，具有強心、升壓、改善微循環等作用，臨床用于休克搶救療效確切[2]。藥理研究表明[3-4]，參附注射液中的強心成分主要為附子中的生物堿成分，附子中的生物堿包括雙酯型生物堿及其水解產物單酯型生物堿，它們既是有效成分又是毒性成分，其中雙酯型生物堿有大毒，單酯型生物堿毒性較小。續海訓[5]報道參附注射液中，雙酯型生物堿基本上全部水解，只含有低毒有效的單酯型生物堿。為進一步評價參附注射液質量，本試驗建立了超高效液相色譜（UHPLC）法同時測定參附注射液中單酯型生物堿的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695超高效液相色譜儀（沃特世）、XPE26電子天平（梅特勒）、UPT-1-40L超純水器（優普），SC-8L-150數控固相萃取儀（廣州智真）。

1.2 試藥與試劑

參附注射液（華潤三九（雅安）藥業有限公司）；苯甲酰新烏頭原堿（批號：111795—201303）、苯甲酰烏頭原堿（批號：111794—201303）、苯甲酰次烏頭原堿（批號：111796—201303）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純（默克）；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液制備

精密稱取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿對照品適量，加異丙醇-二氯甲烷（1∶1）的混合溶液制 57.56 μg/mL苯甲酰新烏頭原堿、55.12 μg/mL 苯甲酰烏頭原堿、53.90 μg/mL 苯甲酰次烏頭原堿的混合對照品貯備溶液。再精密吸取上述貯備溶液適量，加異丙醇-二氯甲烷（1∶1）的混合溶液稀釋制成每1 mL含苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿分別為10.36 μg、9.92 μg、9.70 μg 的混合對照溶液。

2.1.2 供試品溶液制備

精密量取參附注射液10 mL，加于phenomenex Strata-X C18固相萃取小柱（先以15 mL甲醇活化，再以15 mL水平衡），以水5 mL沖洗，再以甲醇1 mL洗脫，用1 mL量瓶收集甲醇洗脫液至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另按參附注射液工藝制備缺附子的陰性樣品，照供試品處理方法制備成陰性樣品溶液。由于參附注射液中生物堿含量較低，需對待測生物堿進行富集，試驗考察了氯仿萃取法、固相柱萃取柱法、氧化鋁萃取法等，結果表明固相柱萃取法所制備的供試品雜質較少[6-8]。同時比較了不同廠家的C8和C18固相萃取小柱以及不同洗脫方法，最終確定了上述供試品溶液的制備方法。

2.2 色譜條件

采用 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 m×100 mm，1.8 μm）色譜柱；以甲醇為流動相A，0.01 mol/L乙酸銨溶液（冰乙酸調pH5.0）為流動相B，等度洗脫（A∶B=39∶61）；流量為 0.4 mL/min；柱溫為 30 ℃；檢測波長為235 nm；理論板數以苯甲酰新烏頭原堿峰計算大于20 000，進樣量1 μL。

2.3 專屬性試驗

精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各1 μL，注入超高效液相色譜儀，按“2.2”項下色譜條件測定，結果陰性樣品對供試品測定無干擾，見圖1，說明本方法專屬性良好。

圖1 對照品（A）、供試品（B）和陰性樣品（C）UHPLC色譜圖

2.4 線性范圍、檢出限和定量限考察

2.4.1 線性范圍

取“2.1.1”項下混合對照品貯備溶液，分別稀釋2、4、8、16、32、64倍，精密吸取不同濃度的對照品溶液各1 μL注入超高效液相色譜儀，按“2.2”項下色譜條件分別測定，以各色譜峰進樣量為橫坐標X（ng），峰面積為縱坐標Y，進行線性回歸，各成分回歸方程及線性范圍見表1。結果表明各成分在線性范圍內與峰面積有良好的線性關系。

表1 線性關系考察

2.4.2 檢測限和定量限

取“2.4.1”項下最小濃度的混合對照品溶液，分別稀釋不同倍數后精密吸取1 μL進樣檢測，考察信噪比（S/N），根據3倍S/N確定檢出限、10倍S/N確定定量限，分別計算出各成分的檢出限和定量限見表2。結果表明采用UHPLC方法檢測時各成分的檢出限和定量限均較低。

表2 各成分檢出限和定量限

2.5 精密度試驗

精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液 1 μL，連續進樣6 次，測得苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿峰面積見表3。RSD分別為1.18%、1.23%、1.07%，表明儀器精密度良好。

表3 精密度考察

2.6 重復性試驗

取同一批參附注射液，按“2.1.2”項下方法，平行制備供試品溶液6份，按“2.2”項下色譜條件測定，結果見表4。6份平行供試品中測得苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰烏頭原堿的含量RSD分別為1.63%、0.91%、1.19%，表明本方法重復性良好。

表4 重復性考察 μg/mL

2.7 穩定性試驗

取同一供試品溶液室溫放置，分別于0，2，4，6，8，12，24 h 按“2.2”項下色譜條件測定，結果見表5。在24 h內苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿含量的RSD分別為1.79%、0.83%、1.09%，表明供試品溶液在24 h內穩定性較好。

表5 穩定性考察 μg/mL

2.8 加樣回收率試驗

根據參附注射液中已知苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的含量，配制相應濃度的混合對照品溶液，分別精密吸取參附注射液共9份，分別精密加入低、中、高3種水平的混合對照品溶液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件測定，結果見表6。苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的加樣回收率均在97.1%～104.8%之間，RSD均小于2%，表明本方法準確度較好。

表6 加樣回收試驗結果

2.9 樣品測定

取10批參附注射液，按“2.1.2”項方法制備供試品溶液，并按“2.2”項下色譜條件測定，計算10批樣品中單酯型生物堿的含量，結果見表7。

表7 參附注射液3種單酯型生物堿含量測定結果 μg/mL

3 討 論

3.1 檢測方法優選

中成藥中烏頭類生物堿含量測定方法文獻報道較多，主要采用的高效液相色譜法[9-12]，而參附注射液中烏頭類生物堿含量測定的研究則較少。本試驗先采用了一般高效液相色譜法，考察了不同流動相及色譜柱對3種單酯型和3種雙酯型烏頭類生物堿的分離效果，結果各色譜峰的響應值較低，出峰時間較長，且基線易發生漂移。后采用超高效液相色譜法，可使基線平穩、各色譜峰響應值較高、峰形較好且出峰較快，見圖2。

圖2 3種單酯型和3種雙酯型烏頭類生物堿UHPLC色譜圖

3.2 參附注射液制備過程酯型生物堿的含量變化情況

參附注射液處方中附子為毒性藥材，主要毒性成分為酯型生物堿。研究表明，雙酯型烏頭堿的毒性為單酯型的50～500倍，為無酯型的2 000倍，而毒性較低的單酯型生物堿被認為是附子的主要藥效物質[13]。通過對5批參附注射液制備過程中關鍵工藝點的酯型生物堿含量進行監測，發現毒性較大的雙酯型烏頭堿逐步降解，成品中總含量為0（見圖3）；而毒性較小的單酯型烏頭堿也在逐步降解，成品中總含量約為提取液的20%（見圖4）。說明參附注射液制備過程是一個減毒過程，而體內動物實驗表明，人參配伍附子后可促進單酯型生物堿的吸收[14]，起到增強藥效的作用。

圖3 參附注射液制備過程雙酯型生物堿含量變化圖

圖4 參附注射液制備過程單酯型生物堿含量變化圖

4 結束語

綜上所述，由于參附注射液中起強心作用的主要藥效物質為單酯型生物堿，但由于其仍具有一定的毒性作用，需對其總含量進行控制。從表7結果可知10批參附注射液中3種單酯型生物堿總含量在3.4～5.1 μg/mL 范圍內波動，均值為4.3 μg/mL，RSD為13.0%，批間較穩定。因參附注射液現行質量標準已采用薄層色譜法對雙酯型生物堿的限量進行了檢查，要求供試品色譜中與烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿對照品色譜相應的位置上出現的斑點應小于對照品斑點或不出現斑點，故建議增加參附注射液中3種單酯型生物堿總含量限度2.5～6.0 μg/mL，以此作為現行質量標準的補充，從而進一步保證臨床用藥的安全性及有效性。