高效液相色譜-二極管陣列法同時測定卷煙爆珠壁材中10種水溶性合成著色劑

李響麗,張鳳梅,范多青,蔡昊城,高 莉，王慶華,胡 燕,李 超

(云南中煙工業有限責任公司技術中心，云南 昆明 650231)

0 引 言

當今卷煙產品研發過程中，通過輔料維度賦香增加越發成為增香增味新趨勢。卷煙濾棒中的“爆珠添加”就是一種新型加香技術，通過在過濾嘴的生產過程中植入香味爆珠，實現在卷煙吸食過程中可控的特色香味被主流煙氣帶出釋放，并且能減少外界環境對吸味的影響和造成香精損失，豐富卷煙吸食口味，實現吸食過程的保潤增濕[1]。爆珠產品由壁材、芯材兩部分構成。芯材主要是包裹的香精，壁材主要是天然膠。為使產品具有風格特征，爆珠壁材使用合成色素生產成彩色樣式。

合成色素大多以從煤焦油中分離出來的苯、甲苯、萘為原料，經一系列有機反應化合而成[2]，具有一定致畸致癌危害[3]。目前依據GB 2760—2011的許可要求，爆珠壁材中使用的水溶性合成著色劑主要包括誘惑紅、莧菜紅、赤蘚紅、胭脂紅、酸性紅、亮藍、日落黃、檸檬黃等，而部分樣品中合成著色劑的用量依據GB 2760—2011使用食品添加劑的限量要求[4]，有可能存在超量風險，但目前對爆珠壁材中合成著色劑用量尚缺乏明確的標準和控制方法。

目前合成著色劑的測定方法主要有薄層色譜法[5]、極譜法[6]、分光光度法[7]、毛細管電泳法[8]、HPLC法[9]、液相色譜-質譜法[10]等，基于對合成著色劑最小檢出量精確（達到納克水平）及簡單快速檢測的需求，當前HPLC能夠同時滿足條件，并且當被測樣品中含有兩種或兩種以上合成色素時，液相色譜法的優勢更加突出，該方法在分析測定合成著色劑時已成為主要的有效方法[11-12]。對卷煙爆珠中的著色劑已有報道，張建鐸[13]等建立了卷煙爆珠中檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、赤蘚紅、誘惑紅、亮藍7種合成著色劑同時檢測的超高效液相色譜-串聯質譜法，劉秀明[14]等利用高效液相色譜測定測定8種檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、酸性紅、赤蘚紅合成著色劑。但對靛藍和喹啉黃同時測定鮮少報道，由于喹啉黃為2-(2-喹啉基)-茚滿基-1,3-二酮單磺酸鈉鹽（QYNa）和 2-(2-喹啉基)-茚滿基-1,3-二酮二磺酸二鈉鹽（QYNa2）的混合物。QYNa、QYNa2各存在兩個同分異構體，QYNa、QYNa2保留時間差異較大，共有4個色譜峰前后出現，給分離帶來了一定難度。本文通過樣品前處理、色譜分離條件優化實驗，建立了HPLC-PDA同時快速測定卷煙爆珠中10種合成著色劑（檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、酸性紅、赤蘚紅、靛藍、喹啉黃）含量的方法，通過建立該種檢測方法并測定含量，將為卷煙開發及安全評價提供參考。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

色譜儀系統：型號Waters e2695高效液相色譜儀（檢測器配置Waters 2998二極管陣列），美國Waters公司生產；超純水儀：型號Milli-Q（美國Millipore公司生產）；電子分析天平：型號AB204-S（瑞士Mettler-Toledo公司生產），精度為0.000 1 g；超聲波水浴鍋：頻率40 kHz，功率400 W，加熱功率320 W，溫度可調室溫～80 ℃（云南樂德科技生產）；過濾器：水相針式過濾器（0.45 μm）。

10種采購自德國Dr. Ehrenstorfer GmbH Company的合成著色劑標準品：赤蘚紅（純度≥91.0%，0.25 g）、胭脂紅（純度≥89.8%，0.1 g）、檸檬黃（純度≥92.5%，0.25 g）、酸性紅（純度≥87.4%，0.1 g）、亮藍（純度≥93.4%，0.25 g）、誘惑紅（純度≥83.0%，0.1 g）、喹啉黃（純度≥90.2%，0.25 g）、莧菜紅（純度≥93.3%，0.25 g）、靛藍（純度≥89.0%，0.25 g）、日落黃（純度≥87.0%，0.1 g）；廣東汕頭市西隴化工廠出產乙酸銨(分析純)；美國 Fisher出產甲醇 (色譜純)。

1.2 標準溶液的配制

1.2.1 標準母液

分別稱取標準品酸性紅、日落黃、檸檬黃、亮藍、胭脂紅、莧菜紅、靛藍、誘惑紅、喹啉黃、赤蘚紅50 mg于50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成濃度為1.00 mg/mL的水溶性合成著色劑標準儲備溶液。

1.2.2 標準儲備液

分別將標準溶液酸性紅、日落黃、檸檬黃、亮藍、胭脂紅、莧菜紅、靛藍、誘惑紅、喹啉黃、赤蘚紅移取2.5 mL于25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成濃度為50 μg/mL的水溶性合成著色劑標準儲備液。

1.2.3 混合標準溶液

準確移取水溶性合成著色劑標準儲備液2 mL于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配置成10 μg/mL的水溶性合成著色劑混合標準溶液。

1.2.4 標準工作溶液

分別移取合成著色劑混合標準溶液于10 mL容量瓶中，用水逐級稀釋，得到濃度分別為0，0.50，1.0 ，2.5 ，5.0 ，7.5 ，10.0 μg/mL 的標準工作溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱 ：Agilent SB-C18 (4.6 mm×250 mm,3.5 μm)；流動相：A相為0.02 mol/L乙酸銨溶液，B相為乙腈，C相為甲醇，梯度洗脫，具體洗脫程序見表1；柱溫：30 ℃；進樣量 10 μL；流量為 0.6 mL/min；運行時間 35 min；DAD掃描范圍：200～800 nm；定量檢測波長：檸檬黃、喹啉黃427 nm，亮藍、靛藍625 nm，莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、酸性紅、赤蘚紅511 nm。

表1 梯度洗脫程序

1.4 樣品的處理

將爆珠從成品卷煙煙支嘴棒中剝離，用吸油紙包裹并擠破爆珠，將香精吸干，稱取0.2 g壁材置于三角錐形瓶中，加入70 ℃超純熱水20 mL，進行超聲提取20 min（超聲水浴鍋設置超聲溫度70 ℃，頻率為40 MHz），靜置分層后，用0.45 μm水相濾膜過濾下層水相溶液，制得待測液。每個樣品平行測定兩次，取平均值得到所測樣品含量。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇和優化

2.1.1 檢測波長的選擇

利用PDA檢測器在190～800 nm波長范圍內對標準溶液進行掃描，將定性定量波長由各個物質最大的吸收波長選取，分別為檸檬黃427 nm、莧菜紅511 nm、胭脂紅511 nm、日落黃511 nm、誘惑紅511 nm、亮藍625 nm、酸性紅511 nm、赤蘚紅529 nm，靛藍625 nm，喹啉黃427 nm。

2.1.2 流動相的選擇

酸性紅、日落黃、檸檬黃、亮藍、胭脂紅、莧菜紅、靛藍、誘惑紅、喹啉黃、赤蘚紅10種水溶性著色劑皆為溶于水的鈉鹽化合物，以甲醇-乙酸銨水溶液（0.02 mol/L）作流動相時，酸性紅和亮藍無法達到基線分離，以乙腈-乙酸銨水溶液（0.02 mol/L）作流動相時，日落黃和喹啉黃2無法分離。最終選擇甲醇-乙腈-乙酸銨水溶液（0.02 mol/L）作流動相時，在優化的色譜條件下，10種著色劑混合標準溶液的色譜圖見圖1。

圖1 10種水溶性著色劑標準工作溶液的色譜圖

2.1.3 色譜柱的選擇

考察 ZORBX SB-C18 (4.6 mm×150 mm,5 μm)對10種著色劑的分離效果和色譜峰形，發現亮藍和喹啉黃3不能完全分離，而色譜柱Phenomenex Luna?-C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm)峰形不理想、而用 Agilent SB-C18 (4.6 mm×250 mm,3.5 μm)可使10種著色劑在柱上得到了較好的保留，從而得到理想的分離效果。

2.2 樣品前處理條件的選擇和優化

2.2.1 溶劑及溶劑溫度選擇

海藻酸鈉基質和明膠基質分別是目前常用的兩種爆珠壁材，海藻酸鈉親水性強，粘性高，可在溫水及冷水條件下溶解，并形成均勻粘稠溶液，是一種高分子化合物。明膠則可以溶于熱水，是一種天然生物高分子材料?；趦煞N基質對水溫的溶解性質，將萃取溶劑選定為熱水。

將明膠基質和海藻酸鈉基質的爆珠分別稱取3 份，在不同溫度梯度（50 ℃、70 ℃、90 ℃）條件下進行提取，觀察壁材溶解的狀態以進行篩選，可知只有達到70 ℃以上條件時溶解才較充分，因此在超聲波水浴鍋中以恒定70 ℃熱水為溶劑進行提取。

2.2.2 超聲提取時間選擇

各稱取兩種基質的爆珠各1份，對比在4個不同時間（5 min、10 min、20 min、30 min）的萃取效果，以壁材溶解狀態為指標進行選擇，在恒溫水浴超聲提取5 min的條件下，兩種基質均無法得到清亮溶液，而在恒溫水浴超聲提取10 min的條件下，以明膠為基質的爆珠壁材可被完全溶解，得到清亮提取液；在20 min、30 min的時間條件下，海藻酸鈉為基質的爆珠出現基質均勻散布于溶液中的現象，得到粘稠均勻溶液。基于上述結果，綜合選擇恒溫水浴超聲提取20 min。

2.2.3 溶劑量選擇

將 2.2.1中的爆珠按 2種基質各稱取 3份（0.2 g/份），精確至 0.000 1 g，分別加入 10 mL、20 mL、50 mL、80 mL 的熱水，用恒溫水浴（70～80 ℃）進行20 min超聲提取，依據結果可見水溶性著色劑在20 mL體積時可被全部提取，因此選擇20 mL作為萃取溶劑量。

2.3 方法的線性關系和檢出限

分別將喹啉黃、酸性紅、誘惑紅、胭脂紅、亮藍、莧菜紅、日落黃、赤蘚紅、靛藍、檸檬黃的混合標準溶液進行調配（范圍 0.2～25.0 μg/mL），繪制出以上述各個合成著色劑濃度為橫坐標、與此相對應峰面積為縱坐標的標準曲線，而后通過回歸分析，獲取以上10種合成著色劑相對應的線性回歸方程和相關系數，連續6次對最低濃度標準溶液進行測定，定量限設定為10倍標準偏差（S/N=10）；檢出限設定為3倍標準偏差（S/N=3），可知以上10種合成著色劑的檢出限（LOQ）范圍位于0.9～11.0 mg/kg之間，定量限統計結果如表2所示。

表2 標準曲線和檢測限1)

2.4 精密度與回收率

以典型檢出的樣品為指標，通過3水平加標方式開展精密度與回收率的檢測實驗，檢測方法回收率與重復性的統計結果可見表3，由此可知回收率區間范圍在82.1%～105.7%之間，相對標準偏差（RSD）區間范圍在1.06%～5.70%之間。

表3 檢測方法回收率與重復性(n=5)

2.5 實際樣品分析

對16個爆珠樣品進行分析（1（深綠色）、2（棕色）、3（玫紅色）、4（深藍色）、5（綠色）、6（橙色）、7（褐色）、8（黃色）、9（橘紅色）；10（深藍色）、11（藍色）、12（天藍色）、13（綠色）、14（淡黃色）、15（深藍色）、16（深藍色）），其中，1～9 號爆珠樣品為海藻酸鈉基質，10～16號爆珠樣品為明膠基質。結果如表4所示，典型的爆珠壁材樣品的HPLC色譜圖如圖2所示，所檢測的10個合成著色劑指標（檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、酸性紅、亮藍、赤蘚紅、喹啉黃、靛藍）中，莧菜紅、誘惑紅和靛藍均未檢出，檸檬黃、亮藍檢出率相對較高。

表4 實際樣品中色素的檢測結果1) mg/kg

圖2 爆珠壁材樣品HPLC色譜圖

3 結束語

本文通過實驗條件的篩選和改進，建立了對煙用爆珠的壁材內部同時測定10種水溶性著色劑的HPLC方法，目前已達到在35 min內可將10種目標物完全進行基線分離的效果。諸多參數（相對標準偏差、線性相關系數、回收率）分析結果均表明，基于實際樣品的檢測需求，該種方法在精確程度和靈敏程度上都能完全達到要求。因此在實際研發生產工作中，該方法可以對各種品牌、各種基質的煙用爆珠壁材開展檢測和定量，以起到對卷煙產品研發和物料安評提供參考評價的作用。