細胞外信號調節激酶1/2在腎癌中的表達及臨床意義

李峰，趙濤，邵繼春

(核工業四一六醫院泌尿外科，四川 成都 610051)

腎癌屬于泌尿系統惡性腫瘤。據統計，全球范圍內每年新增腎癌患者約27萬例腎癌，死亡人數接近11.6萬，目前發病率呈上升趨勢，可能與生活環境、飲食習慣的改變及診斷技術的改進有關[1]。臨床研究證實，腎癌患者對放療、化療不敏感，手術是治療早期腎癌的首選方式[2]，但仍有很大一部分患者術后復發、預后較差。隨著研究的不斷深入，多種基因的異常表達已被證實參與惡性腫瘤的侵襲與轉移。細胞外調節激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族成員，是通過上游MAPK 1/2磷酸化而激活的蛋白激酶/蘇氨酸激酶，該信號通路是由各種細胞外刺激和細胞內信號傳導啟動的，并最終作用于多種生理和病理途徑[3]。近期，Hoerner等[4]指出，磷酸化的ERK1/2(p- ERK1/2)的作為一種關鍵的癌癥信號蛋白，與腎癌的發生及發展密切相關；Lee等[5]也證實ERK1/2在腎透明細胞癌中的表達水平與患者預后相關。本研究通過檢測78例腎癌患者癌組織及癌旁組織中ERK1/2及p-ERK1/2的表達情況，結合患者臨床資料分析其臨床意義，探討其在腎癌發生發展中的作用，為探尋腎癌致病分子機制及治療方向積累數據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年6月至2019年1月于核工業四一六醫院行手術切除的78例腎癌患者為研究對象。入組標準：(1)符合《中國腎癌臨床治療指南：2015版》中腎癌診斷標準[6]經術后病理切片確認；(2)首次行手術切除治療；(3)術前均未接受放療、化療；(4)臨床資料完整。排除標準：合并其他惡性腫瘤患者。78例腎癌患者中，男性50例，女性28例；年齡42～80歲，平均(61.35±18.28)歲；臨床分期Ⅰ-Ⅱ 期患者46例，Ⅲ-Ⅳ 期患者32例；淋巴結轉移患者20例，遠處轉移患者16例；病理Fuhrman 分級為G1者33例，G2+G3者45例。78例腎癌患者經門診或電話隨訪12～60個月，隨訪截止日期為2020年1月31日。本研究經醫院倫理委員會批準，患者自愿參加試驗并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 小鼠抗人ERK1/2單克隆抗體、小鼠抗人p-ERK1/2單克隆抗體(貨號：AM2189b)購自美國ABGENT公司，兔抗小鼠二抗(貨號：PAB9358)購自上海群己生物科技有限公司，DAB 顯色試劑盒(貨號：AR1022)購自武漢博士德生物工程有限公司。ERK1/2及p-ERK1/2陽性對照為已知染色陽性的腎癌組織切片，以磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)代替一抗為陰性對照。

1.2.2 免疫組化法(三步法)測定ERK1/2及p-ERK1/2表達 將手術切除的腎癌及距離病灶超過3 cm的癌旁組織，采用10%的甲醛溶液固定，制成石蠟標本，將標本制備成厚度為4 μm的組織切片；采用二甲苯進行脫蠟，15 min×3 次；采用濃度為90%、85%、75%、70%的乙醇依次浸片，每次5 min；為避免內源性過氧化物酶造成影響，采用3%的H2O2/甲醇溶液浸泡10 min；采用0.125%的乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)胰蛋白酶抗修復液進行30 min的修復；采用胎牛血清封閉30 min，加入一抗小鼠抗人ERK1/2/ p-ERK1/2單克隆抗體(1∶150)于4 ℃條件下孵育過夜；于次日加入標記生物素的二抗羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫條件下孵育30 min，加入二氨基聯苯胺(3，3’-diaminobenzidine，DAB)顯色液，采用自來水充分沖洗后，采用蘇木素染色、脫水、透明、中性樹膠封固。

1.2.3 結果判定 采用雙盲閱片法，由病理科醫師于光鏡下對陽性細胞的數量進行觀察，ERK1/2及p-ERK1/2陽性表達均為細胞核或細胞質內出現黃色或棕黃色顆粒。隨機選取10個高倍視野(×400)對陽性細胞進行計數，參照Beeskey分級方法，每個視野選取100個細胞，以陽性細胞數≥10% 為陽性，以無陽性細胞或陽性細胞數<10%為陰性。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 腎癌組織與癌旁組織中ERK1/2及p-ERK1/2表達情況比較

腎癌組織中，ERK1/2及p-ERK1/2陽性表達率均高于癌旁組織，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 腎癌組織與癌旁組織中ERK1/2及p-ERK1/2表達情況比較[n(%)]

2.2 不同病理特征腎癌患者癌組織中ERK1/2及p-ERK1/2表達情況比較

不同性別、年齡、腫瘤直徑患者癌組織ERK1/2及p-ERK1/2陽性表達率比較，差異無統計學意義(P>0.05)；臨床分期為Ⅲ-Ⅳ 期、有淋巴結轉移、遠處轉移、病理Fuhrman 分級為G2+G3者癌組織中ERK1/2及p-ERK1/2陽性表達率分別高于臨床分期Ⅰ-Ⅱ 期、無淋巴結轉移、遠處轉移、病理Fuhrman 分級為G1者，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同分期腎癌患者癌組織中ERK1/2及p-ERK1/2表達情況比較[n(%)]

2.3 癌組織中ERK1/2、p-ERK1/2表達情況與腎癌患者生存情況的相關分析

Kaplan-Meier生存分析結果顯示，相較于ERK1/2、p-ERK1/2陰性表達者，腎癌組織中ERK1/2、p-ERK1/2陽性表達的患者生存情況較差(χ2=20.207，P<0.001；χ2=17.132，P<0.001)。見圖2。

3 討論

腎臟惡性腫瘤占惡性腫瘤的2%[7]，是世界上第13位最常見的惡性腫瘤，腎癌的發病率在發達國家較高，歐洲和北美的發病率普遍高于印度、非洲和中國[8]。腎癌的發生發展涉及多種因素，隨著表觀遺傳學研究的不斷深入， MAPK/ERK信號通路在一定程度上決定了細胞分裂、分化及凋亡，與惡性腫瘤的發生及發展密切相關，ERK1/2是該通路上較多的蛋白激酶，也是MAPK/ERK信號通路的主要調節因子，正常情況下，位于胞漿內的ERK1/2 處于靜止狀態，磷酸化后的ERK1/2被激活后成為p-ERK1/2，可快速轉移至細胞核，對轉錄因子活性進行調節，最終改變細胞代謝與功能，參與形成惡性腫瘤細胞特定的惡性生物學過程[9-10]。本研究中，78例患者癌組織中ERK1/2及p-ERK1/2陽性表達率均高于癌旁組織(P<0.05)，提示其與腎癌的發生密切相關。劉玉等[11]發現ERK1/2在食管鱗癌石蠟標本癌組織中陽性表達率顯著高于對應癌旁組織；Sinha等[12]發現人透明細胞腎細胞癌細胞內ERK1/2激活，兩者均與本文研究結論基本一致。

通過進一步分析發現，臨床分期為Ⅲ-Ⅳ期、有淋巴結轉移、遠處轉移、病理Fuhrman 分級為G2+G3者的癌組織中ERK1/2及p-ERK1/2陽性表達率更高。仝偉兵等[13]發現，p-ERK1/2陽性表達與患者臨床分期、腫瘤分化程度以及淋巴結轉移情況密切相關；王艷軍等[14]表明，ERk1/2蛋白表達水平增加可能參與肝內膽管細胞癌進展；程楊等[15]證實ERK1/2激活后，宮頸癌細胞株SiHa細胞侵襲能力明顯增強。本研究中Kaplan-Meier生存分析結果顯示，腎癌組織中ERK1/2、p-ERK1/2陽性表達的患者生存情況較差。Zhao等[16]指出，p-ERK1/2的表達被抑制后，腎癌細胞的增殖、遷移和侵襲活性隨之受到抑制；Gao等[17]指出，p-ERK1/2高表達的肝癌患者的總生存期及無復發生存期均較差；Zhao等[18]發現，ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的陽性表達與非小細胞肺癌患者不良預后相關；Fan等[19]指出，在首次確診的多發性骨髓瘤患者中，p-ERK1/2的高表達與總生存期及無復發生存期縮短顯著相關；Lee等[5]發現p-ERK1/2的高表達與無進展生存期縮短相關，不良預后風險較高，以上均與本研究結論一致。但是，本研究樣本量較少，研究結論仍需大樣本多中心試驗進行驗證，ERK1/2能否作為腎癌的治療靶點，仍需進一步分析。

綜上所述，腎癌組織中存在ERK1/2及p-ERK1/2的高表達，且其表達水平與患者臨床分期、淋巴結轉移、遠處轉移、病理Fuhrman 分級及生存期相關。